本產(chǎn)品是基因包涵體微量純化試劑盒的大提升級(jí)產(chǎn)品， 用于大量，快速的提取高質(zhì)量的包涵體。它具有下列特點(diǎn)：

1. 大量提取，1 次可處理多達(dá) 5 升的菌液，相當(dāng)于 50 次中量提取。

2. 適合制備級(jí)別的包涵體純化，需在 50 mL 以上的離心管或離心瓶中完成。

3. 能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白在包涵體中所占比重達(dá)到 60%以上。

4. 即可以選擇高壓裂解法，也可以采用酶學(xué)裂解法裂解細(xì)菌。

得到的包涵體可以用于重折疊，也可以用于凝膠層析和動(dòng)物免疫

運(yùn)輸及保存常溫運(yùn)輸，4℃保存（溶菌酶需要-20℃保存，包涵體溶解液可以室溫保存），有效

期一年。

自備試劑如果得到的重組蛋白確有降解則需要自備蛋白酶抑制劑混合物（CAT#：80808）

使用方法一．細(xì)胞沉淀：

1.轉(zhuǎn)移 1-5 升菌液到干凈的、預(yù)稱重量的塑料離心瓶中。如果離心瓶體積不夠大， 可以分多次反復(fù)離心收集。

2.5,000 g （相當(dāng)于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭 5500 rpm） 4℃離心 15-30 分鐘，小心棄上清。

3.復(fù)稱重量，差值就是細(xì)菌的濕重。1 升的過夜培養(yǎng)的大腸桿菌濕重一般為 3 克， 所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克細(xì)菌。注意：后續(xù)操作的很多溶液都是按此步得到得細(xì)胞濕重添加。

4.細(xì)胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二．細(xì)胞裂解(下面兩法中選其一)：

高壓破碎法（French Press）+超聲法（推薦方法）

1.按每克細(xì)菌濕重加入 3 mL 溶液 A 重懸細(xì)胞，可以用玻璃棒攪拌或用 Waring搗碎機(jī)勻漿（如果細(xì)菌濕重超過 10 克）使細(xì)菌懸浮，直到檢測(cè)不到成塊的細(xì)

胞為止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其終濃度為 0.2mg/mL。

2.讓細(xì)胞通過壓力為 16000-18000 lb/in2 的高壓細(xì)胞破碎儀，收集的細(xì)胞裂解液需放冰上。

3.重復(fù)上步操作一次或多次，直到絕大部分細(xì)菌都被裂解。注意：每次處理后最  好在顯微鏡下檢查細(xì)菌裂解的比例。

4.將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理 5 分鐘，工作狀態(tài)為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）。此過程中最好將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會(huì)使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。

酶法+超聲法（在沒有高壓破碎儀器時(shí)首選方法）

1.按每克細(xì)菌濕重加入 3 mL 的含溶菌酶的溶液 A 重懸細(xì)胞，可以用玻璃棒攪拌細(xì)菌沉淀使之懸浮。

2.在細(xì)菌懸浮液中加入溶菌酶干粉，使其終濃度為 0.2mg/mL，攪拌混勻后 37℃放置 30 分鐘裂解細(xì)菌，其間不時(shí)需要用玻璃棒混勻。細(xì)菌釋放出的 DNA 將使裂解物變得十分粘稠。如果不粘稠，說明裂解不充分，需要繼續(xù)裂解，否則  完整細(xì)菌將和包涵體一起沉淀，影響包涵體的純度。由于處理量大，最好在顯  微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。

3.將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理 5 分鐘，工作狀態(tài)為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）。此過程中最好將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會(huì)使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。

三．包涵體純化：

1.將超聲處理的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心瓶中，22，000g 4℃下高速離心 60 分鐘

（注意：轉(zhuǎn)子不同其對(duì)應(yīng)的離心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重組蛋白，可以保留作為 SDS-PAGE 對(duì)照樣品。

2.將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在預(yù)冷的溶液 B 中。每克細(xì)菌需要 5 mL 溶液 B，1 升細(xì)菌的濕重約 3 克，大約需要 15 mL 溶液 B，用玻璃棒或勻漿器攪拌混勻后室溫放置 5 分鐘。

3.22，000g 4℃下高速離心 30 分鐘，沉淀將出現(xiàn)三層，最下面的是未徹底破裂的細(xì)胞碎片，其上是包涵體，最上層的松軟沉淀是細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜。如果處  理過程中使用過溶菌酶，則此層較薄。小心收集上清，可以作為包涵體第一次  洗滌的對(duì)照樣品。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

4.

重復(fù)第 8-第 9 步直到上清變清和最上層細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜松軟沉淀消失，此過程一般需要重復(fù)洗滌 2 次（共 3 次洗滌），小心收集上清作為包涵體第二次洗滌和第三次洗滌的對(duì)照樣品。本試劑盒提供的溶液 B 足夠一次 5 升規(guī)模的提取洗 3 次，如需更多溶液 B 請(qǐng)單獨(dú)購(gòu)買。

5.上步得到的沉淀即為包涵體，其中重組蛋白一般占 60%重量，其余 40%為其他蛋白質(zhì)。此沉淀可以長(zhǎng)期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫動(dòng)物制備抗體，還可以直接進(jìn)入下面得包涵體的溶解步驟。

6.估計(jì)重組蛋白的產(chǎn)率：首先需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)知道重組蛋白的表達(dá)水品，如果表  達(dá)水平為 1%，則 1 克濕重的細(xì)菌中將含有 1 mg 重組蛋白質(zhì)。此法得到的重組蛋白質(zhì)的回收率一般在 75%，即 1mg 重組蛋白質(zhì)能得到 0.75 mg，丟失0.25mg。

四．包涵體的溶解：

1.在室溫下，將包涵體溶解液加入到包涵體沉淀中，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩。  如果需要將溶解的包涵體直接用于凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，則按每克原始細(xì)胞濕重加入 1 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 4-5 mg/mL；如果需要將溶解的包涵體直接用于蛋白質(zhì)折疊，則按每克原始細(xì)胞濕重加入 3 mL 包涵體溶解液, 重組蛋白的濃度約為 1-2 mg/mL；注意：包涵體溶解液低溫放置會(huì)產(chǎn)生沉淀，必須 45-65℃溶化并混勻后才能使用。

2.室溫放置 1 小時(shí)使蛋白質(zhì)充分溶解。

3.100,000g 4℃離心 60 分鐘(轉(zhuǎn)速需要根據(jù)離心機(jī)轉(zhuǎn)子的大小換算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力。SDS-PAGE 檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有完全溶解，  需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。

4.將上清（溶解的包涵體）分成 10-20mL 一份，放于塑料離心管中（不要超過離心管容量的 70%）置-80℃長(zhǎng)期保存或直接用于復(fù)性等試驗(yàn)。由于不同的蛋白質(zhì)有不同的最佳復(fù)性條件，需要用戶自己摸索。包涵體純化過程中引入了溶  菌酶，在 SDS-PAGE 分析時(shí)可能有額外條帶出現(xiàn)。

包涵體微量提取試劑盒（CAT#：90508-50），包涵體中量提取試劑盒（CAT#： 90509-5）