非洲豬瘟(African Swine Fever、ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus、ASFV) 引起豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，病死率幾乎高達(dá) 100%，ASF 最近在我國(guó)爆發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，因此ASFV 的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的 ASFV 可視化 LAMP 檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA。
2. 用 LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增法擴(kuò)增 ASFV 特異片段，不需要熒光 PCR 等貴重儀器。同時(shí)擴(kuò)增時(shí)間只需要 1 小時(shí)，尤其適合現(xiàn)場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)條件簡(jiǎn)陋的單位使用。
3. 檢測(cè)靈敏性比PCR 高 10 倍以上。
4. 特異性高，由于使用四條針對(duì) ASFV 保守基因的特異引物，比使用 2 條引物的PCR 專一性更高。
5. 每個(gè)反應(yīng)的線性范圍：10E2-10E7拷貝/μL ,
6. 最低靈敏度：10 拷貝/μL 。
7. 提供無(wú)傳染性的陽(yáng)性對(duì)照，便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本試劑盒足夠做 50 次 20μL 體系的 LAMP 擴(kuò)增。本產(chǎn)品只能用于科研。
| 成份 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
| 2×可視化UNG-LAMP MagicMix | 180703a | 500μL（綠蓋） |
| 非洲豬瘟病毒 LAMP 引物混合液 | 16-23000yw | 200μL（白蓋） |
| 非洲豬瘟病毒 LAMP 陽(yáng)性對(duì)照 （1×10E8 拷貝/μL） | 60908-23000pc | 50μL（黃蓋） |
| 使用手冊(cè) | 16-23000sc | 1 份 |
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。非洲豬瘟病毒陽(yáng)性對(duì)照 2.0 最好單
獨(dú)放置，不要污染其他試劑。
待測(cè)樣品
一、樣品 DNA 的制備
1. 用自選方法純化病毒樣品DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容，包括本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。
2. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要做 N+2 個(gè)樣品制備，包括一個(gè)樣品制備陽(yáng)性對(duì)照（PC）和一個(gè)樣品制備陰性對(duì)照（NC）。樣品使用量根據(jù)所選擇的試劑盒決定。如果樣品使用量為 XmL，則在 XmL 水中加 10μL MRSA LAMP陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液作為樣品制備陽(yáng)性對(duì)照。樣品制備陰性對(duì)照是直接用 X mL 水作為 陰性對(duì)照，然后和 N 個(gè)樣品一起進(jìn)行細(xì)菌 DNA 提取操作。得到N+2個(gè)DNA樣品。
二、LAMP（20μL 體系）
反應(yīng)設(shè)置：如果有 N+2 個(gè) DNA 純化樣品，則最好設(shè)置 N+4 個(gè) LAMP 擴(kuò)增，增加一個(gè) LAMP 陰性對(duì)照和 LAMP 陽(yáng)性對(duì)照。在 N+2 個(gè)PCR 管中加入下列成分：
| 成分 | N+2 個(gè) 樣品管 | 陰性對(duì) 照管 | 陽(yáng)性對(duì) 照管 |
| 2× 可視化 UNG-LAMP MagicMix | 各 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| 非洲豬瘟病毒LAMP 引物 混合液 | 各 4μL | 4 μL | 4 μL |
| N+2 樣品 DNA 模板 | 各 6 μL | - | - |
| LAMP 陰性對(duì)照（水） | - | 6 μL | - |
| LAMP 陽(yáng)性對(duì)照（用非洲豬瘟病毒LAMP 陽(yáng)性對(duì)照的 100 倍稀釋液） | - | - | 6 μL |
2. 混勻，此時(shí)反應(yīng)液呈現(xiàn)非常淺的藍(lán)色，由于是否有反應(yīng)是跟陰性對(duì)照和反應(yīng)前對(duì)比，所以一定要設(shè)置陰性對(duì)照，并且反應(yīng)前要手機(jī)照相留存以供反應(yīng)后比對(duì)。
3. 置于25℃5分鐘（讓UNG滅活可能的LAMP的污染），然后放63℃擴(kuò)增60-120分鐘（如果不使用Loop引物，則最好保溫2小時(shí)）。如果是在PCR 儀中保溫，必須加熱蓋。如果用金屬浴保溫，沒有熱蓋，必須在孔中加水以填充孔和管子間的空隙，并且在管中加50uL石蠟油，否則保溫期間反應(yīng)體系的水分會(huì)蒸發(fā)，影響反應(yīng)效率）。
4. 80℃10分鐘滅活Bst DNA聚合酶和UNG酶。
5. 將反應(yīng)管放置在白色背景（如白紙）前觀察，觀察反應(yīng)液顏色并用手機(jī)照相留底。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。陽(yáng)性對(duì)照將呈現(xiàn)藍(lán)色，無(wú)模板的陰性對(duì)照將呈現(xiàn)無(wú)色或非常淺的藍(lán)色，樣品管的顏色如果接近陽(yáng)性對(duì)照則說明有擴(kuò)增，如果接近陰
性對(duì)照則說明無(wú)擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)結(jié)果如下圖（9 號(hào)為陰性，10 號(hào)為陽(yáng)性，此處的 9 號(hào)和 10 號(hào)跟下步的電泳照片中的 9 號(hào)和 10 號(hào)是相同的兩個(gè)樣品）：
9. 如果需要也可以電泳確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：取 10μL LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行 2%瓊脂糖凝膠電泳（本產(chǎn)品不需要單獨(dú)加 loading buffer），最好使用 100 bp DNA Marker。如果樣品為陽(yáng)性，將會(huì)得到長(zhǎng)度為 200bp 的梯形擴(kuò)增產(chǎn)物。典型的電泳結(jié)果見下表（奇數(shù)樣為陰性結(jié)果，偶數(shù)樣為陽(yáng)性結(jié)果。此處的 9 號(hào)和 10 號(hào)跟上步照片中的 9 號(hào)和 10 號(hào)是相同的兩個(gè)樣品）
10. 注意消除環(huán)境污染，LAMP 產(chǎn)物易產(chǎn)生氣溶膠，飄在空氣中影響下一次實(shí)驗(yàn)，建議反應(yīng)結(jié)束后，用紫外滅菌。先加好除陽(yáng)性對(duì)照和樣品以外的其它溶液，到另一個(gè)房間添加陽(yáng)性對(duì)照及樣品，可有效防止引物、MagicMix
被污染。
