產(chǎn)品及特點(diǎn)
支原體和親緣關(guān)系很近的無(wú)膽甾原體、螺旋體統(tǒng)稱霉形體。霉形體是目前發(fā)現(xiàn)的最小的、最簡(jiǎn)單的原核生物。它們?nèi)狈?xì)胞壁、有變形能力、能通過(guò)濾菌器、 可在無(wú)生命培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，成為細(xì)胞培養(yǎng)中常見的一種污染源，嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)率、細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞代謝和細(xì)胞活力。因此快速靈敏檢測(cè)支原體具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)支原體高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
| 成份 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
| PCR MagicMix 3.0 | 90805 | 1 mL（紅蓋） |
| 超純水 | 100935 | 1 mL（亮黃蓋） |
| 支原體通用 PCR 引物混合液 | 13-74000yw | 100 μL（白蓋） |
| 支原體通用 PCR 陽(yáng)性對(duì)照 （1×10E8 拷貝/μL） | 13-74000pc | 50 μL（黃蓋） |
運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
自備試劑：樣品 DNA。
使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
5.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的核酸釋放劑，使用后其裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好
后最后加）：
| 成分 | N+2 個(gè) 樣品管 | PCR 陰性 對(duì)照管 | PCR 陽(yáng)性 對(duì)照管 |
| PCR MagicMix 3.0 | 各 20 μL | 20 μL | 20 μL |
| 支原體通用 PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 2 μL |
| N+2 個(gè)樣品 DNA 模板 | 各 18 μL | - | - |
| PCR 陰性對(duì)照（超純水） | - | 18 μL | - |
| PCR 陽(yáng)性對(duì)照（支原體通用 PCR 陽(yáng) 性對(duì)照的 10000 倍稀釋液） | - | - | 18 μL |
12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
| 過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 5 min |
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PCR 反應(yīng) （35 個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 30 sec |
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| 55℃ | 30 sec |
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| 72℃ | 60 sec |
| 最后延伸 | 72℃ | 10 min |
四、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 34。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 34 則為陰性，如果小于或等于 30則為陽(yáng)性。如果在 30-34之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值，如果大于或等于 34 則為陰性，如果小于 30，則為陽(yáng)性。
