鴨坦布蘇病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒鴨坦布蘇病毒(Duck Tambusu Virus，TMUV)是一種RNA病毒，會引起一種以鴨出血性卵巢炎為主要病變特點(diǎn)的新發(fā)、急性、烈性傳染病，病鴨表現(xiàn)為采食減少，產(chǎn)蛋率迅速下降，種蛋受精率降低10%左右，體溫升高，排綠色稀糞，后期神經(jīng)癥狀明顯，表現(xiàn)癱瘓、翻個，公鴨睪丸出血、萎縮，精子質(zhì)量下降、受精率低，給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此鴨坦布蘇病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：
1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)鴨坦布蘇病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。
| 成 份 | 編號 | 十孔盒包裝 |
| 2×qRT-PCR 緩沖液 | 190101a | 500 μL（棕色管） |
| 10×qRT-PCR酶混合液 | 190101b | 100 μL（紅蓋） |
| ROX染料I | 190101c | 50 μL（棕色管） |
| ROX染料II | 190101d | 50 μL（棕色管） |
| 熒光PCR專用模板稀釋液 | 180701 | 1mL（亮黃蓋） |
| 鴨坦布蘇病毒RT-PCR引物混合液 | 14-55000yw | 100 μL（白蓋） |
| 鴨坦布蘇病毒RT-PCR陽性對照 （1×10E8拷貝/μL） | 14-55000pc | 50 μL（黃蓋） |
| 天凈沙核酸釋放劑試用裝 | 61202 | 20次（1mL，綠蓋） |
| 使用手冊 | 14-55000sc | 1份 |
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA片段作為陽性對照。
一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
2. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
5. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）�？梢�用水作為制備的陰性對照。
6. 用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
7. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個，其余不變。
在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：
| 2×qRT-PCR 緩沖液 | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL |
| 50×ROX (見注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL |
| 樣品制備所得RNA模板（來于第8步） | 5.6μL | 不加 | 不加 |
| 稀釋所得6個陽性對照（來于第6步） | 不加 | 不加 | 各5.6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
| 10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用ROX染料I的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用ROX染料II的機(jī)型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。1. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| RT（逆轉(zhuǎn)錄） | 50℃ | 15-30分鐘 |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 2分鐘 |
| RT - PCR反應(yīng) （30個循環(huán)） | 95℃ | 15 秒 |
| 60℃ | 15 秒（采集FAM通道的熒光信號） | |
| 72℃ | 15 秒 | |
| 按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析 | ||
四、數(shù)據(jù)處理
1. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性
