1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)人細(xì)小病毒 B19 高度保守的 VP1 區(qū)設(shè)計。
PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。
| 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
| 2×qPCR MagicMix | 90408 | 0.5 mL（棕色） |
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
| 細(xì)小病毒 B19 PCR 引物混合液 | 14-30900yw | 100 μL（白蓋） |
| 細(xì)小病毒 B19 PCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 14-30900pc | 50 μL（紅蓋） |
| DNA 病毒裂解液試用裝 | 3674a | 15 次（9 mL） |
| 使用手冊 | 14-30900sc | 1 份 |
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能
污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所
得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性
對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）�？梢杂� 10μL 上步制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
| 成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 細(xì)小病毒 B19 PCR 引 物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待測樣品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號） |
不加 |
不加 | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
五、數(shù)據(jù)處理
11. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
五、電泳檢測
12. 如果有必要電泳確認(rèn)，可取 10-20 uL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)
物的大小為 400 bp。
