| 花生源性成分染料法熒光定量 PCR 試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有花生的成分。現(xiàn)代食品加工工藝極大 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 改變了食材原有的味道、氣味、色澤、紋理和質(zhì)地等特性，因此傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 經(jīng)無法對食材的真偽進行準(zhǔn)確的鑒定。同時部分食材還有致敏性，因此基于基因檢測的 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 快速靈敏的食材來源檢測技術(shù)將對食品監(jiān)管和安全提供重要的保障。本產(chǎn)品就是為滿足 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 這一需求根據(jù) PCR 原理開發(fā)的產(chǎn)品，它具有下列特點： | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 2. 根據(jù)花生保守區(qū)域設(shè)計引物，能專一性地檢測出樣品中的花生成分，但不能檢測其 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 他非花生成分。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 4. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 5. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 6. 提供陽性標(biāo)準(zhǔn)品，便于分析實驗結(jié)果。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 7. 對混合樣品中花生成分的檢測下限為 0.01%，對樣品中花生成分的核酸檢測下限 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 為 0.1ng/µL。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 8. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的熒光定量 PCR。
|
低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時，由于其濃度較
高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。最好在專門的區(qū)域操作。
| 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo) |
| 準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本 |
| 試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣 |
品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 二、樣品 DNA 的制備
7.用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8.如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對 照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的 DNA 釋放 劑試用裝。則按下面步驟操作：
9.配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個樣品）為例：在一干凈塑料 管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合 均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內(nèi)用完，不要長期放置。一 次檢測一個樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品。如果待 測樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。
10. 在標(biāo)記好的 N+2 個離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大�。┗� 5uL 液 體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照，在樣品制備陰性對 照中加入 5uL 水。
11. 在每個管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣 品則震蕩混勻
12. 95℃保溫 10 分鐘。
13. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個樣品得到的 DNA
釋放液足夠進行 50-100 次 PCR。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）
14. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個 樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（也充當(dāng) PCR 陽性對照）。 如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
15. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢
后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
| 成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix （棕色管） | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 花生源性成分 PCR 引物 混合液（白蓋） | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自備 10×ROX (見注) | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待測樣品 DNA 模板 | 各 6 μL | 不加 | 不加 |
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣 品稀釋液（2-7 號） |
不加 |
不加 | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
|
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene |
| 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。 |
| 16. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qPCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù) qPCR 儀器的 |
| 不同而自行優(yōu)化）。 |
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min |
|
PCR 反應(yīng) （35 個循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min |
|
| 60℃ | 0.5 min（采集 SYBR 通道的 熒光信號） |
|
| 72℃ | 0.5 min |
