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禽病毒性關(guān)節(jié)炎染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

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 禽病毒性關(guān)節(jié)炎染料法熒光定量RT-PCR試劑盒具有下列特點:

1.即開即用,用戶只需要提供 DNA 模板。

2.引物根據(jù) EB 病毒專一區(qū)設(shè)計,特異性高。

3.熒光定量PCR 檢測,比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4.一管式閉管操作,降低了交叉污染。

5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷

 

成分

十孔盒包裝

qPCR Magic Mix

500 μL棕色管

熒光PCR 專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋

病毒染料法 qPCR 引物混合液

100 μL(白蓋)

病毒染料法 qPCR 陽性對照

(1×10E8 拷貝/μL)

50 μL黃蓋

使用手冊

1 份

運輸及保存:低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。

自備試劑:DNA 模板、超純水、10×ROX(根據(jù)機型決定,具體見使用方法)。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 個 10 倍稀釋度為例)

1. 注意:由于陽性對照濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2. 標(biāo)記 個離心管,分別為 7,65,4,3,2。

3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。

4.在 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5.換槍頭,在 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)

充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6.換槍頭,在 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 號管中,充分震蕩 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7.重復(fù)上面的操作直到得到 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備

8.如果有 個樣品,必須設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),

一個是 NC(樣品制備陰性對照)?梢杂 10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋的(稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL10μL 相當(dāng)于 萬拷貝,可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,充分混勻,此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,充分混勻,此為 10000 倍稀釋液)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡V苽渌贸蔀闃悠 DNA。

9.用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20 μL 體系,在樣品制備室進行)

10.如果做定量分析并且只做 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,個用于 PCR 陰性對照,個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品,個用于PCR 陰性對照(用水做模板),個用于PCR 陽性對照(用第 號陽性對照稀釋液,濃度為 14810 拷貝/μL)。下面只描述定量分析的步驟, 定性分析只是把 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 個,其余不變。

11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢

后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)

成分

樣品管

N+2 個

PCR 陰性

對照管

PCR 陽性

對照管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

染料法qPCR 引物混

合液

2 μL

2 μL

 2 μL

自備 10×ROX (見注)

2 μL

2 μL

 2 μL

N+2 待測樣品 cDNA 模板

6 μL

-

-

自備超純水

-

6

-

第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液(2-7 號

 

-

 

-

 6μL2 號樣到

2 號管,3 號樣到 3

號管…)

:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ OptionMJ Chromo4、MX3000MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行 PCR(具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。

 

四、數(shù)據(jù)處理

13.如果把禽病毒性關(guān)節(jié)炎染料法熒光定量RT-PCR試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,

以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值,再推算出其濃度。

14.如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 36。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 34 則為陰性,如果小于或等于 30 則為陽性。如果在 30-34 之間,則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 34,擴增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性

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