偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV) 會引起偽狂犬病，病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異：哺乳仔豬最為敏感，15 日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為最急性型，主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀、發(fā)抖、運(yùn)動不協(xié)調(diào)、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運(yùn)動，最后昏迷死亡；育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高，呼吸困難，一般不發(fā)生死亡，耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒；成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高，一般不發(fā)生死亡。母豬妊娠初期，可在感染后的 20 天左右發(fā)生流產(chǎn)，在妊娠后期，經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊，或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū)，偽狂犬病被認(rèn)為是對經(jīng)濟(jì)影響最大的豬病毒病，因此偽狂犬病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的偽狂犬病病毒探針法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)偽狂犬病病毒設(shè)計(jì)，不會跟其他病毒株 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
本產(chǎn)品只能用于科研。
| | 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
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| 2×Probe qPCR Magic Mix | 190303 | 500 μL（本色蓋） |
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| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
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| 偽狂犬病病毒探針法 qPCR 引物 混合液 | 同 15-35100yw | 100 μL（白蓋） |
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| 偽狂犬病病毒 qPCR 探針 | 同 15-35100pb | 50 μL（棕色管） |
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| 偽狂犬病病毒探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 同 60908- 35100pc | 50 μL（黃蓋） |
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| 使用手冊 | 同 15-35100sc | 1 份 |
| 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。 | |||
| 樣品 DNA。 | |||
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能
污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性
對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）�？梢杂� 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)
11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
| | N+2 個 | 性對照管 | 樣品管（2-7 管） |
| 2×Probe qPCR Magic Mix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 偽狂犬病病毒 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
| 偽狂犬病病毒探針法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 個待測 DNA 模板 | 7 μL | - | - |
| 超純水 | - | 7 μL | - |
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （2-7 號） |
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- | 各 7 μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
四、數(shù)據(jù)處理
11. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
12. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct
值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性
