| 產(chǎn)品及特點 | 新型布尼亞病毒， 衛(wèi)生部門從蜱蟲中毒者體內分離出的病毒。或將被認定為 一種新型病毒。從目前來看， 這一病毒主要由蜱傳播， 且可以治療， 病死率很低。 目前未發(fā)現(xiàn)人傳染人的病例。布尼亞病毒自然感染見于許多脊椎動物和節(jié)肢動物 (蚊、 蜱、白蛉等)， 可感染小鼠， 并能在一些哺乳類、鳥類和蚊細胞培養(yǎng)中生長; 對人可引起類似流感或登革熱的疾病、出血熱(立夫特谷熱和克里米亞─剛果出血 熱等)及腦炎(加利福尼亞腦炎)。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒 3 種傳播類型。 本產(chǎn)品以 探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測新型布尼亞病毒的試劑盒， 它具有下列特點： 1. 即開即用， 用戶只需要提供樣品 RNA 模板。 2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。 3. 提供陽性對照， 便于區(qū)分假陰性樣品。 4. 特異性高， 引物是根據(jù)新型布尼亞病毒高度保守區(qū)設計， 不會跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應。 5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。 6. 本產(chǎn)品只能用于科研。 | ||
| 規(guī)格及成分 | 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
| 探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 190504a | 500 μL（藍蓋） | |
| 探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 190504b | 100 μL （紅蓋） | |
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| 180701 |
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| 15-83700yw |
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| 新型布尼亞病毒 qRT-PCR 探針 | 15-83700pb | 50 μL （棕色管） | |
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陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 60908-83700pc |
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| 使用手冊 | 15-83700sc | 1 份 | |
| 運輸及保存 | 低溫運輸， -20℃保存，保存期限為 12 個月。 | ||
| 自備試劑 | 樣品 RNA。 | ||
| 使用方法 | 一、稀釋標準曲線樣品 （以 10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例） 。 由于標準品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行， 千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照， 只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。 1. 標記 6 個離心管，分別為 7， 6， 5， 4， 3， 2。 | ||
| 2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液， 最好用帶芯槍 頭，下同） 。 3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。 4. 換槍頭， 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。 5. 換槍頭， 在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。 6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備 7. 如果有 N 個樣品， 最好設置 N+2 個提取， 多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照） ，一個是 NC（樣品制備陰性對照） 。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣， 以此作為 PC 。 另外用水作為 NC。 8. 用自選方法純化樣品的 RNA， 本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑 盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。 三、 Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系， 在樣品制備室進行） 9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管， 其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品， 1 個用于 PCR 陰性對照 （用水做模板）， 6 個用于標準曲線。如果做定性分析， 并且只做 1 次重復， 則標記 N+4 個 PCR 管， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品， 1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板） ， 1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板） 。 下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。 樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照， 并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后最后加）： | |||
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成分 | 樣品管 N+2 個 | RT-PCR 陰性對照 管 | 標準曲線 樣品管 （2-7 管） |
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| 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
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| 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
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| 新型布尼亞病毒探針法 qRT-PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
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| 待測樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | - | - | ||||||||||||||||
| 超純水 | - | 5 μL | - | ||||||||||||||||
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第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 （2-7 號） |
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- | 各 5 μL （2 號樣到 2 號 管， 3 號樣到 3 號管 …） | ||||||||||||||||
| 11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：
五、 數(shù)據(jù)處理 12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的log值，再推算出其濃度。 13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須 大于或等于35。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線， Ct 值應 該小于或等于 33。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性， 如果 小于或等于 33 則為陽性。如果在 33-35 之間，則重復一次。 若重復結果 Ct值小于 35， 擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。 | |||||||||||||||||||
