| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有 T3 啟動(dòng)子的模版DNA，以 NTP 為底物，從 T3 啟動(dòng)子下游開(kāi)始合成與模板 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的RNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的 RNA 分子。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)： 1. 即開(kāi)即用，用戶只需提供含 T3 啟動(dòng)子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，不需單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。 2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。 3. 模板 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。 4. 可以合成的 RNA 的最佳長(zhǎng)度在 20 nt 到 5000 nt 之問(wèn)。 5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，每μg DNA 模板可以合成 2-6 μg RNA。 6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA- 蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。 | ||||
| 規(guī)格及成分 |
| 成份 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
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| 2×T3 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液 | 91108a | 0.5 mL（本色蓋） | |||
| T3 RNA 聚合酶混合液 | 120309 | 50 μL（紅色蓋） | |||
| RNase-free 水 | 80403 | 1 mL（亮黃蓋） | |||
| 使用手冊(cè) | 91108sc | 1 份 | |||
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期一年。 | ||||
| 自備試劑 | 如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA 模板，則需要RNase-free DNase 、Tris 飽 和酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇（均可從本公司另購(gòu)） | ||||
| 使用方法 | 一、制備 DNA 模板 PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)?/span>限制性內(nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動(dòng)子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物，則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T3 啟動(dòng)子序列 （5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T3 啟動(dòng)子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T3 啟動(dòng)子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如選擇了Pst I 來(lái)線性化質(zhì)粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修 平。四是必須保證 DNA 模板中沒(méi)有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過(guò)程中 | ||||
一般要使用大量的RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測(cè) RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留RNase A。
二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
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| 但所用試劑需另行購(gòu)買，本試劑盒不提供。 1.在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。 2.37℃保溫 15-30 分鐘。 3. 補(bǔ)水到 100 μL， 4. 用自備的等體積（100 μL）的Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase 和 RNA 聚合酶。 5. 在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。 6. 加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。 7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。 8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA�？扇苡� RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長(zhǎng)期保存。 |
| 答客問(wèn) | 1、沒(méi)有 RNA 產(chǎn)物。最常見(jiàn)原因是 DNA 模板有 RNase 污染，測(cè)試方法是將純化的有兩條典型 RNA 條帶的總 RNA 跟模板 DNA 一起保溫，再檢測(cè) RNA 是否降解。本試劑盒緩沖液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染嚴(yán)重，可能需要用戶補(bǔ)加 RNase inhibitor。 2、RNA 產(chǎn)量低。最常見(jiàn)的原因是 DNA 模板序列。在轉(zhuǎn)錄序列的第一個(gè)和第二個(gè)堿基最好都是G，在前 14 個(gè)堿基內(nèi)避免有U 存在。 3、RNA 長(zhǎng)度比預(yù)期的短。可能是模板序列中有T3 RNA 聚合酶的終止序列。可以改用 SP6 或 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（啟動(dòng)子也必須做相應(yīng)的改變）。 4、RNA 長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)。T3 RNA 聚合酶跟Taq DNA 聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以帶一個(gè)或兩個(gè)堿基的尾巴。如果 RNA 長(zhǎng)度比預(yù)計(jì)的長(zhǎng)很多，使用的模板又是質(zhì)粒 DNA，則可能是質(zhì)粒DNA 線性化不徹底。 5、5’單磷酸還是三磷酸。如果使用 GTP，則得到的 RNA 是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時(shí)如果保溫時(shí)間太長(zhǎng)（如 12 小時(shí)），則有 50%的三磷酸會(huì)變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入 GMP，則 T3 RNA 聚合酶將優(yōu)先使用 GMP，所得RNA 產(chǎn)物中 5’端是單磷酸的比例將大大增加。 6、如何得到帶帽 RNA？需加入帶帽 NTP 類似物即可，NEB 提供 5 種供選擇。 |
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（CAT#:91106）、SP6 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（CAT#:91107） |
