線粒體 DNA 提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核 DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體，再利用 DNA 酶消化和裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核 DNA，最后得到純凈的線粒體 DNA�？捎糜� PCR 等對(duì)純度要求較高的實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒用于從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體 DNA 的提取制備。

試劑存儲(chǔ)
本試劑盒整體保存于 2-8℃一年，Dnase I -20℃保存。使用前，在 DNase I 中加入 600ul（50T）或者 1200ul（100T）的DNA 酶反應(yīng)液，分裝后-20℃保存三個(gè)月，如果超過(guò)三個(gè)月，活性可能會(huì)降低，請(qǐng)自行訂購(gòu) DNASE I。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可 37℃水浴溶解，不影響使用。

使用參考

準(zhǔn)備工作： ：在 Dnase I 中加入 600ul（50T）或者 1100ul（100T）的 DNA 酶反應(yīng)液，適當(dāng)分裝后-20℃保存。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀 37℃水浴溶解，離心機(jī)溫度下降到 4℃（2-8℃），如無(wú)低溫離心機(jī)，也可以常溫離心，并將離心時(shí)間為 10min 的改為 5min，但最后所得 DNA 品質(zhì)及產(chǎn)量可能會(huì)有一定影響。

1.  樣本采集前處理：無(wú)論田間自然生長(zhǎng)還是實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)，采摘前須避光生長(zhǎng) 24-48 小時(shí)，以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量植物細(xì)胞裂解液，加入 0.5% β-巰基乙醇，如 10ml 植物細(xì)胞裂解液加入 50ulβ-巰基乙醇，混勻，形成植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，此溶液可 2-8 度保存一個(gè)月。

2. 葉片用蒸餾水清洗 2-3 次，濾紙吸干，有條件請(qǐng)用液氮研磨葉片 1-2 克，研磨完后，取 800mg 左右研磨的葉片粉，加入1.5ml 預(yù)冷的植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，混勻。如果無(wú)條件（無(wú)液氮），請(qǐng)預(yù)冷研缽，取洗過(guò)的葉片 1000 mg，用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入 1.5ml 預(yù)冷的植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，冰上研磨至看不見(jiàn)明顯組織塊；

3. 將研磨物放置合適的離心管，4℃，1000× g 離心 5 min；

4. 將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，在沉淀中加入 0.5ml 植物細(xì)胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，混勻，再次 4℃，1000× g 離心5 min，取上清；合并兩次上清，將上清 4℃ 1000× g 再次離心 5 min。

5．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 16,000 × g 離心 10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

6. 在線粒體沉淀中加入 0.5 mL 線粒體清洗液重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心 5 min；

7．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 16,000 × g 離心 10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

8. 加入 100ul DNA 酶反應(yīng)液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入 10ul DNASE I 溶液（見(jiàn)準(zhǔn)備工作），混勻，37℃水浴 10min。此步為消化線粒體表面吸付的核 DNA。4℃， 12,000 × g 離心 5 min。盡可能的棄上清，再加入 200ul TE 重懸線粒體沉淀，4℃，12,000 × g 離心 5 min，洗去殘留的 DNA 酶。

9.得到的沉淀，用 200ul TE 緩沖液重懸線粒體沉淀，加入 10ul RNase A。加入 200ul 線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置 1-2min，再加入 150ul 蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃， 12,000 × g 離心 5 min。此步驟可進(jìn)一步去除核 DNA。

10．取上清，加入一新的離心管中（如用于酶切分析，可加入此步：選用等體積的酚氯仿異戊醇 25:24:1 抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提兩次，一般來(lái)說(shuō)，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會(huì)造成線粒體 DNA 的損失，因而用于 PCR 時(shí)可省，并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)），加入 0.6 倍體積的異丙醇（如無(wú)異丙醇，可加入 2.5 倍體積的乙醇沉淀 DNA，如離心管太滿可分兩管）及 5-10ul 核酸核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時(shí)左右（此步可省），4℃， 12,000 × g 離心 10 min。

11. 棄上清，再加入 1ml 70%乙醇清洗，4℃， 12,000 × g 離心 5min。重復(fù)用 70%乙醇洗一次。

12. 棄上清，再次離心 1min 吸棄上清，不要碰到管底，開(kāi)蓋涼干約 5-10min。

13．加入 20-30ul TE 緩沖液,輕彈管底，37℃水浴 5 分鐘，線粒體 DNA 溶解。

14. 進(jìn)行 DNA 電泳檢測(cè)及-20℃保存，進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)。（由于部分植物線粒體本身 DNA 含量很低，可以富集多個(gè)樣本合并濃縮或進(jìn)行 PCR 檢測(cè)）

注意事項(xiàng)
1. 以離心力 g 計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
2. 進(jìn)行 Western Blot 和 2D-膠電泳，可直接在第 7 步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體。
3. β-巰基乙醇有毒，請(qǐng)注意通風(fēng)及防護(hù)

附：一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示，如果沒(méi)有，可以用以下公式簡(jiǎn)單的換算。
轉(zhuǎn)速與離心力換算
G＝1.11×(10 -5 )×R×[rpm] ²
G 為離心力，一般以 g（重力加速度）的倍數(shù)來(lái)表示；
[rpm]² 即：轉(zhuǎn)速的平方； R 為半徑，單位為厘米。