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單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)試劑盒

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 意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

 

 

測定意義:

 

MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

 

 

測定原理:

 

MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA  NAD+,NADH  340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+沒有。通過測定 340 nm 光吸收下降速率,來計算出 MDHAR 活性。

實驗中所需儀器及設(shè)備:

 

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

 

 

試劑組成和配置:

 

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

 

試劑二:液體 20mL×1 瓶,室溫保存。

 

試劑三:粉劑×1 瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水充分溶解。

 

試劑五:液體 15μL×1 瓶,4℃保存。臨用前加 3 mL 試劑二充分溶解。

 

 

粗酶液提。

 

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。

 

2.. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~10001 的比例(建

 

 500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);8000g ,4℃離心 20min,取上清液置冰上混勻待測。

 

3. 血清等液體:直接測定。

 

 

MDHAR 測定操作:

 

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min,調(diào)節(jié)波長到 340 nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。

 

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 試劑三、20μL 試劑四、20μL 試劑五和 120μL 試劑二,最后加入 20μL 上清液,迅速混勻后于 340nm 比色,記錄 30s  150s 的吸光值 30s

 

和 150s 的吸光值 A1  A2,A=A1-A2

 

 

MDHAR 活性計算公式:

 

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

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