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HiFi One-Step RT-PCR Mix

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本試劑采用穩(wěn)定高效的RT-PCR預(yù)混體系,是以RNA為模板進行一步法RT-PCR的專用試劑。其原理為用基因特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得第一鏈cDNA(不可使用Oligo(dT)或Random Rimer合成第一鏈cDNA),再使用基因特異性正向引物和反向引物進行PCR擴增,在同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部過程。反應(yīng)體系中已含有電泳所需的指試劑(藍色和黃色),反應(yīng)后可以直接進行電泳。
在本試劑中,將耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成50×One-Step Enzyme Mix預(yù)混液;反應(yīng)Buffer、dNTP以及電泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此使得操作更加簡單便,擴增產(chǎn)物可用于平端克隆和DNA測序。

組分

組分名稱 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
注意:1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高,第一次使用之前要離心收集至反應(yīng)管底部,吸取時應(yīng)緩慢小心。
2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶,反應(yīng)配制可在常溫進行,但各組分應(yīng)-20°C保存。

主要特征

  • 耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶可在55℃反應(yīng)能更好的打開復(fù)雜二級結(jié)構(gòu),只需10min即可完成逆轉(zhuǎn)錄。
  • DNA聚合酶為熱啟動型高保真酶,能夠有效的抑制非特異性反應(yīng)且具有較高的校正活性,酶激活僅需2min。
  • 具有寬泛的模板量兼容性,10 ng~1μg都可有效擴增。
  • 反應(yīng)過程中無需開蓋,避免了操作過程中的污染危害。

儲存

請置于-20°C,可保存2年;避免反復(fù)凍融。

實例

1.以Hela細胞總RNA為模板,使用HiFi One Step RT PCR Mix擴增不同長度的目的片段。電泳結(jié)果顯示,166bp~4128bp 的 DNA 片段都得到了良好的擴增。
基因名稱 模板使用量
gDNA:500bp、2kb、5kb、8kb、12kb ≤2kb 50ng
2kb~8kb 100ng
>8kb 200ng
λDNA:500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb 50 ng
Hela cDNA:166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp ≤2kb 相當mRNA 50ng
>2kb 相當mRNA 200ng

>1000 bp

1000~3000 bp

>3000 bp

55°C,10min

55°C,10min

55°C,10min

95°C,2min

95°C,2min

95°C,2min

95°C,20s

58°C,20s

72°C,30s32cycles

95°C,20s

58°C,20s

72°C,1min20s32cycles

95°C,20s

58°C,20s

72°C,2min 5s32cycles

72°C,2min

72°C,2min

72°C,2min

M:D10000 DNA Marker,1-7分別為:β-actin(166bp)、GAPDH (552bp)、GAPDH(960bp)、BMP2 (1574bp)、PRKN (1705bp)、TFRC (2755bp)和TFRC( 4128bp)。

2. 以Hela細胞總RNA為模板,使用不同的RNA模板量(1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg)進行HiFi One Step RT PCR Mix擴增。電泳結(jié)果顯示,三種不同長度的片段都獲得良好的擴增,過多的模板可能會抑制擴增。

960bp

1574bp

4128bp

55°C,10min

55°C,10min

55°C,10min

95°C,2min

95°C,2min

95°C,2min

95°C,20s

58°C,20s

72°C,30s32cycles

95°C,20s

58°C,20s

72°C,1min20s32cycles

95°C,20s

58°C,20s

72°C,2min 5s32cycles

72°C,2min

72°C,2min

72°C,2min

M:D10000 DNA Marker,1-9分別為1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg的 RNA模板擴增產(chǎn)物。
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