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3173 DNA聚合酶

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3173 DNA Polymerase為來(lái)源于病毒的熱穩(wěn)定型DNA聚合酶，通過(guò)點(diǎn)突變修飾，使其3’-5’外切活性缺失（exo-形式）而獲得更佳的擴(kuò)增活性。該酶除了具有依賴于DNA的聚合酶活性，還具有依賴于RNA的逆轉(zhuǎn)錄活性，因此可用于單管RT-PCR擴(kuò)增。該酶具有強(qiáng)烈的鏈置換活性，可用于DNA或RNA的等溫?cái)U(kuò)增。在以RNA為模板的LAMP實(shí)驗(yàn)中，可實(shí)現(xiàn)單酶系統(tǒng)反應(yīng)。對(duì)于有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板，可通過(guò)92度加熱3s來(lái)得到好的擴(kuò)增效果，而B(niǎo)st pol在此溫度加熱后導(dǎo)致擴(kuò)增活性喪失。
3173 DNA 聚合酶在95°C條件下的半衰期為20min，因此PCR的起始預(yù)變性時(shí)間通常為1~2min。該酶搭配兩種Buffer：10×3173 Isothermal Buffer和5×Best PCR Buffer。10×3173 Isothermal Buffer用于恒溫PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)溫度不能超過(guò)70°C。 5×Best PCR Buffer用于常規(guī)PCR擴(kuò)增，94°C預(yù)變性時(shí)間不可超過(guò)5min。

主要特征
  • 同時(shí)具有較強(qiáng)的延伸能力和逆轉(zhuǎn)錄活性
  • 耐熱性能極強(qiáng)，對(duì)于復(fù)雜模板的擴(kuò)增活性強(qiáng)
  • 強(qiáng)烈的鏈置換活性，可應(yīng)用于LAMP檢測(cè)

組分
組分名稱 數(shù)量
3173 DNA Polymerase (5 U/μl) 100 μl
10×3173 Isothermal Buffer 1 ml
5×Best PCR Buffer 1 ml

單位定義
一個(gè)活力單位即在65°C條件下，30分鐘內(nèi)催化25nmol dNTP的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。

應(yīng)用
  • 恒溫PCR擴(kuò)增
  • DNA LAMP和RT-LAMP
  • 鏈置換基因合成
  • 在60-70度之間具有反轉(zhuǎn)錄活性，可用于單管RT-PCR

儲(chǔ)存
-20℃可保存3年。

使用方法
1.以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系配制
3173 DNA Polymerase (5 U/μl)                     1 μl
5×Best PCR Buffer                                    10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                        4 μl
模板DNA                                              1ng~1ug
上游引物（10 μM）                                       5 μl
下游引物（10 μM）                                       5 μl
ddH2O                                              Up to 50 ul		 PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù) 
循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間
1st Cycle 90°C 2min
25-40 Cycles 90°C 15s
Tm 15s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min
2.以RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系配制
3173 DNA Polymerase (5 U/μl)                     1 μl
5×Best PCR Buffer                                    25 μl
dNTP Mixture (10 mM each)                        5 μl
模板RNA                                            10ng~1ug
上游引物（10 μM）                                     2 μl
下游引物（10 μM）                                     2 μl
ddH2O                                           Up to 50 ul		 PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù) 
循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間
1st Cycle 60°C 60min
35 Cycles 90°C 15s
57°C 15s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min
3.缺刻恒溫PCR擴(kuò)增
3173 DNA Polymerase (5 U/μl)                   1 μl
10×3173 Isothermal Buffer                         5 μl
dNTP Mixture (10 mM each)                      5 μl
模板DNA                                         10ng~1ug
引物（500 μM）                                         5 μl
ddH2O                                           Up to 50 μl
55°C孵育2~8h。
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