| 尿嘧啶DNA糖基酶(Uracil N-Glycosylase,UNG)又名Uracil-DNA Glycosylase, UDG, 為來源于E. coli uracil N-glycosylase基因的重組表達蛋白，分子量為26kDa。它可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶，但對RNA無活性。 UNG主要應(yīng)用于PCR擴增產(chǎn)物的防污染，作用原理基為：如果在PCR反應(yīng)中以dUTP替代dTTP摻入DNA中，形成了含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物，該酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U基的糖苷鍵，降解該PCR擴增產(chǎn)物。 | ||||||
組分 | ||||||
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應(yīng)用 | ||||||
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活性定義 | ||||||
| 在標準PCR反應(yīng)體系下，37℃條件下，1小時降解1µg含dU堿基的單鏈DNA的酶量為一個活性單位。 | ||||||
活性測試 | ||||||
 取1μg dUTP PCR產(chǎn)物，用UNG 37℃消化30min后進行瓊脂糖凝膠電泳。 Lane 1：對照（不加UNG酶）；Lane 2-7：分別為 2U、0.5U、0.125U、0.032U、0.008U、0.002U UNG酶37度消化30min后的PCR產(chǎn)物；M：D2000 DNA Marker。 | ||||||
性能測試 | ||||||
 UNG在標準PCR體系下（50ul體系）性能測試。 處理方法為：在反應(yīng)體系中分別加入不同量的UNG（如圖所示），50度2min，95度5min，然后進入PCR循環(huán)擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。Lane 1-3：標準dNTP Mixture，UNG用量0.25U/0.5U/1U; Lane 4-6：dNTP/dUTP Mixture，UNG用量0.25U/0.5U/1U；M：D10000 DNA Marker。 | ||||||
反應(yīng)buffer | ||||||
| Uracil DNA Glycosylase (UNG)與絕大多數(shù)的PCR 聚合酶反應(yīng)緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100mM)下活性會受到抑制。 | ||||||
酶保存液 | ||||||
| 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 | ||||||
儲存 | ||||||
| -20℃可保存2年，避免反復(fù)凍融。 | ||||||
熱失活 | ||||||
| 95℃，5min。 | ||||||
 取1μg dUTP PCR產(chǎn)物進行UNG熱失活測試。 Lane 1：對照（不加UNG酶）；Lane 2: 1U UNG酶37度消化30min；Lane 3： 1U UNG酶95度加熱5min后，再加入PCR產(chǎn)物消化(37度消化30min)； Lane 4： 1U UNG酶95度加熱10min后，再加入PCR產(chǎn)物消化(37度消化30min)；M: D2000 DNA Marker。 | ||||||
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