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Gibson無縫連接試劑盒

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Gibson無縫連接試劑盒是一種混合酶系統(tǒng)，其可將任意方法線性化的載體和與其兩端具有重疊區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)PCR片段定向重組連接。該方法不依賴于T4 DNA連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點(diǎn)限制，可在30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)PCR片段高效定向無縫克隆至載體的任意位置，從而獲得完整的雙鏈DNA分子。該試劑盒使用簡單，只需加入合適比例的載體和PCR片段在室溫孵育15-30min即可完成片段的連接。

優(yōu)勢
  • 室溫孵育即可完成片段的連接,無需50℃。
  • 不受載體或插入片段酶切位點(diǎn)限制在任意位置進(jìn)行無縫克隆
  • 不依賴于T4連接酶，高效連接，無堿基缺失
  • 可同時(shí)高效連接一個(gè)或多個(gè)PCR片段
  • 無需額外的亞克隆，菌檢陽性率高達(dá)95%

原理
  • T5外切酶可從雙鏈DNA5'端切割形成3'突出末端， 從而促進(jìn)重疊區(qū)域的具有互補(bǔ)序列的片段進(jìn)行退火。
  • 高保真DNA聚合酶可使退火的片段向3'端延伸，從而填補(bǔ)片段缺口。
  • Taq DNA連接酶可封閉缺刻從而獲得完整的雙鏈DNA分子。
Gibson無縫克隆試劑盒

組分
組分名稱 10T 50T
2XGibson Assemble Mix 50μl 250μl

儲(chǔ)存
-20℃可保存2年，-80℃可保存5年，避免反復(fù)凍融。

檢測效果和應(yīng)用實(shí)例
(1). KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector獲得線性化載體，插入與載體有25nt同源臂的引物擴(kuò)增Gp32基因（966bp），然后應(yīng)用2xGiboson Assembly Mix連接線性化載體和Gp32，室溫孵育15min，然后取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜后菌檢。其中左圖為長斑情況對比，A為對照（不加片段）B為實(shí)驗(yàn)組（Gp32片段），右圖為挑取32個(gè)斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳，其中陽性檢出率為31/32(~97%)。
(2).PCR 擴(kuò)增pCold-sumo-M vector獲得線性化載體，插入與載體有15nt同源臂的引物擴(kuò)增Bsu基因（1.4kb），然后應(yīng)用2xGiboson Assembly Mix連接線性化載體和Bst，室溫孵育30min，然后取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜后菌檢。其中左圖為長斑情況對比，A為對照（不加片段）B為實(shí)驗(yàn)組（Bsu片段），右圖為挑取40個(gè)斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳，其中陽性檢出率為40/40(~100%)。
(3).以單片段連接為例，載體與片段不同摩爾比對連接效率的影響。載體2742bp，片段2439bp，使用載體與片段摩爾比分別為2:1;1:1;1:2;1:3;1:4;1:5 室溫連接30min；片段5’和3’端與載體同源序列大小都為17bp，使用通用引物菌檢，陽性條帶應(yīng)為2598bp。 結(jié)果表明：載體與連接片段選用不同摩爾比對于菌斑數(shù)和菌檢陽性率的影響較大，綜合推薦摩爾比1:5。圖中1-6代表載體與片段摩爾比分別為2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。
(4).以單片段連接為例，不同的載體量對連接效率的影響。載體2742bp，片段2439bp，使用載體與片段摩爾比為1:5，載體用量分別為0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol室溫連接30min；片段5’和3’端與載體同源序列大小都為17bp，使用通用引物菌檢，陽性條帶應(yīng)為2598bp。 結(jié)果表明：載體用量在0.01~0.015pmol之間，菌斑數(shù)和菌檢陽性率較高。圖中1-4分別代表載體用量為0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol。
(5).多片段連接
單片段連接：載體長2742bp，片段1長2439bp，使用載體與片段摩爾比為1:5，載體用0.01pmol，室溫連接30min，片段5’和3’端與載體同源序列大小都為17bp，使用通用引物菌檢，陽性條帶應(yīng)為2598bp。
雙片段連接：片段2長654bp， 片段3長1802bp，載體長2742bp，載體與片段摩爾比為1:5（片段2和3皆為0.05pmol），載體用0.01pmol，室溫連接30min，各片段之間的同源序列長度皆為17bp，通用引物菌檢陽性條帶為2598bp。
三片段連接：片段2長654bp， 片段4長822bp，片段5長997bp，載體長2742bp，載體與片段摩爾比為1:5（片段2、4和5皆為0.05pmol），載體用0.01pmol，室溫連接30min，各片段之間的同源序列長度皆為17bp，通用引物菌檢陽性條帶為2598bp。
圖中1-3分別為單片段、雙片段和三片段連接，A-E為PCR擴(kuò)增連接所需片段，分別為片段2：654bp，片段1：2439bp，片段3：1802bp，片段5：997bp，片段4：822bp， 結(jié)果表明：單片段連接的效率顯著高于雙片段和三片段連接，在進(jìn)行雙片段和三片段連接時(shí)，陽性菌檢率在50%左右，可多挑取菌斑進(jìn)行菌檢。
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