| 本試劑盒所包含的原核表達(dá)載體(pCold-SUMO-10His)是在pCold-SUMO載體基礎(chǔ)上改造而成，該載體啟動(dòng)子(CS Promoter)來源于南極嗜冷細(xì)菌，在低溫下(15度)才能啟動(dòng)蛋白的表達(dá)。低溫下細(xì)菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達(dá)，增強(qiáng)了活性蛋白的表達(dá)比率。該表達(dá)系統(tǒng)所包含的SUMO tag可以極大地提高小分子量蛋白的表達(dá)量，而且能進(jìn)一步提高蛋白的可溶表達(dá)幾率。另外，TEE信號(hào)肽可增強(qiáng)冷啟動(dòng)子調(diào)控下目的蛋白的高表達(dá)。 升級(jí)后的pCold-SUMO-10His載體，其SUMO蛋白標(biāo)簽含有10個(gè)組氨酸標(biāo)簽（10His tag），使其結(jié)合Ni-NTA的能力更強(qiáng)。與較早版本的pCold-SUMO表達(dá)系統(tǒng)相比，pCold-SUMO-10His表達(dá)系統(tǒng)在保留了原有系統(tǒng)的蛋白可溶性生產(chǎn)能力、高特異性剪切能力的情況下，顯著提高了與Ni-NTA的結(jié)合能力。通過與Ni-NTA結(jié)合能力的提高，在以下三個(gè)方面改善了生產(chǎn)重組蛋白的性能：（1）提高了粗蛋白樣品中目標(biāo)蛋白的捕獲能力，從而提高純化產(chǎn)量；（2）在蛋白純化過程中可以使用更高濃度的咪唑進(jìn)行漂洗，去雜蛋白的能力明顯提升，從而獲得更高純度的重組蛋白；（3）在重組蛋白酶切去除SUMO標(biāo)簽后，利用Ni-NTA去除SUMO標(biāo)簽更為徹底，獲得純度更高的無標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
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組分 | ||||||||||||||||||||||||||||||
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主要特征 | ||||||||||||||||||||||||||||||
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應(yīng)用 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 包涵體蛋白的最佳解決方法，提高蛋白的可溶性優(yōu)化表達(dá)。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
實(shí)例 | ||||||||||||||||||||||||||||||
 | Fig1 . M. 中分子量蛋白Marker 1. 未誘導(dǎo) 2. pET15b系統(tǒng)表達(dá)全菌體蛋白 3.pET15b系統(tǒng)表達(dá)上清液(可溶蛋白部分) 4.pCold-SUMO表達(dá)于BL21(DE3)全菌體蛋白 5.pCold-SUMO表達(dá)于BL21(DE3)上清液(可溶蛋白部分) 6.pCold-SUMO表達(dá)于BL21(DE3)chaprone全菌體蛋白 7.pCold-SUMO表達(dá)于BL21(DE3)chaprone上清液(可溶蛋白部分) 8.使用Ni-NTA Resin純化SUMO融合蛋白 9.切除SUMO tag后的目的蛋白 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 泳道2和3表明使用pET系統(tǒng)表達(dá)幾乎無可溶性蛋白表達(dá)，皆為包涵體；泳道4和5表明使用pCold-SUMO系統(tǒng)于BL21(DE3)菌中，可溶性蛋白表達(dá)約占40%；泳道6和7表明使用BL21(DE3)chaprone可進(jìn)一步提高蛋白的可溶性表達(dá)。 | ||||||||||||||||||||||||||||||
 | Fig2. 分別用2 μl和5 μl的SUMO蛋白酶（C0801）對(duì)100 μg pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 表達(dá)所得對(duì)照蛋白進(jìn)行酶切1h或3h，如圖所示。M：Protein Marker，泳道1：純化后的含SUMO標(biāo)簽的對(duì)照蛋白； 泳道2：2μl SUMO Protease 酶切1h產(chǎn)物；泳道3：5μl SUMO Protease 酶切1h產(chǎn)物； 泳道4：2μl SUMO Protease 酶切3h產(chǎn)物；泳道5：5μl SUMO Protease 酶切3h產(chǎn) | |||||||||||||||||||||||||||||
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