一、稀釋 PCR 陽性對(duì)照（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）
如果做定性實(shí)驗(yàn)，則此步可以跳過。如果做定量實(shí)驗(yàn)，則需要稀釋陽性對(duì)照做標(biāo)
準(zhǔn)曲線。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬
不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產(chǎn)品只提供 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下
同）。
3. 在 6 號(hào)管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照（試劑盒提供），充分震蕩
1 分鐘， 得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照（上步稀釋所
得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是樣品制備 PC（樣品制
備陽性對(duì)照），一個(gè)是樣品制備 NC（樣品制備陰性對(duì)照）�？梢杂� 10μL 陽性對(duì)
照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，
以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（
20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于
上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)
曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2
個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用
于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管中的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析
為描述操作步驟，
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