GV3101 農桿菌感受態(tài)細胞
GV3101 Chemically Competent Cell
保存條件： -80℃
產(chǎn)品規(guī)格:
| GV3101 | 10x100μl |
| pCAMBIA2301 (control vector) | 10ng/ul ；10ul |
| 基 因 型 |
C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline
| 簡 要 說 明 |
GV3101 菌株為 C58 型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因 rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一 無自身轉運功能的胭脂堿型 Ti 質粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA) ，此質粒含有 vir 基因(vir 基因是 T-DNA 插入植物基因 組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的 T-DNA 轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體 T-DNA 順 利轉移)。 pMP90 (pTiC58DT-DNA)型 Ti 質粒含有篩選標簽：Strep 和gent ，賦予 GV3101 菌株鏈霉素和慶大霉素抗 性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作，GV3101 化轉感受態(tài)經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng) pCAMBIA2301 質粒檢測轉化效率可達 104cfu/μg。
| 操 作 說 明 |
1. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。
2. 每 100μl 感受態(tài)加 1ug (體積不大于 10ul) 質粒 DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置 5 分鐘、液氮 5 分鐘、 28℃水浴 5 分鐘、 冰浴 5 分鐘。
3. 加入 700μl 無抗生素的 LB 或 YEB 液體培養(yǎng)基， 于 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時。
4. 6000rpm 離心一分鐘收菌，留取 100μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的 LB 或 YEB 平板上，倒 置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 天(當平板只含有 50ug/ml kan 時，28℃培養(yǎng) 48h 即可；平板中同時加入 50ug/ml kan ，20ug/ml rif 時， 需 28℃培養(yǎng) 60h ；如果使用的平板含有 50ug/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90h)。
| 注 意 事 項 |
1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的 1/10 ；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大
一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。
2. 混入質粒時應輕柔操作。
3. 轉化高濃度的質�？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
4. 利福平濃度不應高于 25ug/ul ，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受 態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有 50ug/ml kan ，若所用平板含有 20ug/ml rif 則轉化效率降低到 1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、 篩選農桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質 粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti 質粒丟失的 概率極低(可以忽略)。
備注：
1. 農桿菌相關抗生素配方：
| 抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
| 羧芐青霉素(carb) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 50mg/ml | 50ug/ml |
| 硫酸卡那霉素(kan) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 50mg/ml | 50ug/ml |
| 鏈霉素(strep) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 10mg/ml | 50ug/ml |
| 利福平(rif) | DMSO 溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 10mg/ml | 20ug/ml |
| 慶大霉素(gent) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 20mg/ml | 40ug/ml |
2. 常用農桿菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
| 農桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
| AGL- 1 | R | R | R | S | S |
| EHA105 | S | R | R | S | S |
| LBA4404 | S | R | R | S | S |
| GV3101 | S | R | R | R | S |
3. LB 及 YEB 配方：
| component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
| Tryptone | 10g | 10g | Tryptone | 5g | 5g |
| Yeast extract | 5g | 5g | Yeast extract | 1g | 1g |
| NaCl | 10g | 10g | 牛肉浸膏 | 5g | 5g |
| NaOH | 調 PH 到 7.0 | 調 PH 到 7.0 | 蔗糖 | 5g | 5g |
| Agar | － | 15g | MgSO4 *7H2O | 0.49g | 0.49g |
|
|
|
| NaOH | 調 PH 到 7.0 | 調 PH 到 7.0 |
|
|
|
| Agar | － | 15g |
