| 產(chǎn)品及特點 | 本產(chǎn)品是基于蛋白質(zhì)鹽析和透析原理開發(fā)的非變性蛋白質(zhì)濃縮產(chǎn)品。其原理是將大量具有很強水化能力的硫酸銨加到蛋白質(zhì)溶液中，奪取蛋白質(zhì)分子的水化層（尤其是蛋白質(zhì)表面非極性區(qū)的水化層），使之“失水”，于是蛋白質(zhì)分子間的非極性基團將互相結(jié)合，使蛋白質(zhì)形成沉淀，離心分離沉淀后，再用透析方法將蛋白質(zhì)中的鹽除去，即得濃縮的蛋白質(zhì)。本產(chǎn)品的特點如下： 1. 適合于濃縮各種蛋白質(zhì)粗提液，一次可以處理 50 mL 蛋白質(zhì)溶液。 2. 非變性法，不會破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和活性，尤其是適用于對變性敏感的酶溶液。 3. 得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適合于長期保存。 4. 可以在透析是進行緩沖液的調(diào)換。 5. 一站式，帶有鹽析和透析所需的物品。 | ||||
| 規(guī)格及成分 |
| 成 份 | 編 號 | 10 次包裝 |
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| 溶液A | 81029A | 50 mL×10 |
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| 無菌水 |
| 50 mL |
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| EDTA 溶液(0.5M) |
| 0.5 mL |
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| 使用手冊 | 81029sc | 1 份 |
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| 運輸及保存 | 常溫運輸和保存，有效期一年。 | ||||
| 自備試劑 | 透析液。 | ||||
| 使用方法 | 注意：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)樣品需在 4℃環(huán)境下（如冷室）操作外，一般可在室溫中操作，操作者整個操作須戴好手套。 一：鹽析沉淀 1、 測量待濃縮蛋白質(zhì)樣品的體積，并將其轉(zhuǎn)移到容積至少是樣品體積兩到三倍的無菌燒杯或玻璃三角瓶中。注意：需要處理的蛋白質(zhì)樣品最好溶解在 pH 為中性的緩沖液中（如 50 mM 的 Tris-HCl），濃度最好在 1mg/mL 以上。 2、 將一個無菌的磁力攪拌子放入三角瓶中，再將三角瓶放置在磁力攪拌器上，打開開關(guān)后緩慢攪拌。注意：攪拌過程中不能產(chǎn)生泡沫。 3、 如果待濃縮蛋白容易被金屬離子失活或抑制，則最好加入 EDTA 溶液， 使其終濃度為 10 mM，否則此步可省略。 | ||||
4、 根據(jù)所需硫酸銨的飽和度計算需要加入的溶液 A 的體積，溶液 A 的硫酸銨飽和度是 100%。一般 50%的硫酸銨飽和度就可以沉淀絕大部分蛋白，超過此飽和度溶液比重很大，難以通過離心收集蛋白質(zhì)沉淀。
7、 將溶液輕移到旋蓋塑料離心管或離心瓶中，在平衡條件下 15000×g 4℃離心 15 分鐘。注意：溶液比重很大，一定要重量上平衡而非體積平衡。
8、 小心棄上清，得到蛋白質(zhì)沉淀。此沉淀可以在 4℃放置數(shù)月。
9、 將盡可能少的無菌水或其他緩沖液加入蛋白質(zhì)沉淀中使之溶解，所加體積一般是沉淀物體積的 1-2 倍。如果沉淀溶解后非常粘稠，可以適當(dāng)補加無菌水使其變得不粘稠。此沉淀可以在 4℃放置幾天。
10、如果溶液中有不溶物（主要是變性的蛋白質(zhì)），可以 15000×g 4℃離心
11、上清液可以用于 SDS-PAGE 電泳檢測或 UV 法蛋白質(zhì)濃度測定。
12、如果后續(xù)純化方法是疏水層析或排阻層析，則不需要將溶液中殘留的鹽去掉，可以直接使用。如果后續(xù)純化是離子交換層析，則需要將溶液中殘留的鹽去掉，一般采用透析法，具體操作見附一。
附一：透析脫鹽
1、 將蛋白溶液轉(zhuǎn)移到一端已經(jīng)封口的透析袋內(nèi)，預(yù)留一些液體膨脹的空間，然后將另一端封口。注意：用戶需要預(yù)處理透析袋，預(yù)處理的方法是將透析袋在含 2%（W/V）碳酸氫鈉和 1 mM EDTA 的溶液中煮沸 10 分鐘，用蒸餾水徹底清洗透析袋，然后放在 1 mM EDTA 的溶液中煮沸 10分鐘并浸沒在此溶液中冷卻，最后放 4℃保存待用。取用時必須要戴手套。
2、 將透析袋放置在裝有透析液的容器中，透析液的體積必須是蛋白質(zhì)溶液的 20-100 倍，溶液最好處于攪拌狀態(tài)。用戶可以用適合后續(xù)實驗的任何緩沖液作為透析液。每次透析 3-4 小時，共透析 2-3 次�？梢杂米詡�的萘氏試劑檢測透析袋外面溶液是否還有殘留的銨離子來檢測透析是否完成。
3、 將透析后的溶液全部轉(zhuǎn)移到離心管中，15000×g 4℃離心 15 分鐘，上清液即為濃縮后的蛋白溶液。可以放-80℃冰箱保存或立即用于后續(xù)的實驗。
4、 如果需要快速測定蛋白質(zhì)的濃度，可取少許樣品作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，用紫外分光光計測 280nm 和 260nm 的光吸收，再計算其濃度，計算公式為：蛋白濃度(mg/mL)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×樣品稀釋度。
附二：多克隆抗體的濃縮
1、 將待處理的血清樣品在 4℃或室溫 20000×g 離心 30 分鐘，收集上清。
2、 取上清 20mL 與等體積的自備生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加 40 mL 溶液 A。注意：加等量生理鹽水的目的是將蛋白質(zhì)含量降低到 2.5-3.0%，否則其他蛋白質(zhì)會跟抗體一起共沉淀。
3、 冰上放置 30 分鐘以上或過夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀。
4、 將溶液轉(zhuǎn)移到旋蓋塑料離心管中，15000×g 4℃離心 10 分鐘，棄上清。
5、 用 12 mL 自備生理鹽水溶解蛋白質(zhì)沉淀。
6、 于攪拌下緩慢滴加 8 mL 溶液A，冰上放置 1 小時使蛋白充分沉淀。
7、 將溶液轉(zhuǎn)移到旋蓋塑料離心管中，15000×g 4℃離心 10 分鐘，棄上清。
8、 用 13.3 mL 生理鹽水溶解蛋白質(zhì)沉淀。
9、 于攪拌下緩慢滴加 6.6 mL 溶液 A，冰上放置 1 小時使蛋白充分沉淀。
10、將溶液輕移到旋蓋塑料離心管中，15000×g 4℃離心 10 分鐘，棄上清。
11、用少許生理鹽水溶解蛋白質(zhì)沉淀，并轉(zhuǎn)移到透析袋中。
12、用大于 20-100 倍體積的PBS 于 4℃對蛋白質(zhì)溶液進行透析，更換透析液數(shù)次，然后讓蛋白質(zhì)溶液置-80℃保存或用其他方法進一步純化。
