AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞
AH109 Chemically Competent Cell
產(chǎn)品規(guī)格:10×100μl
保存條件： -80℃
AH109
10×100μl
保存條件： -80℃
Carrier DNA
5ug/μl；100 μl
保存條件 -20℃
PEG/liAC
5 ml
保存條件： 4℃
基 因 型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,
MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
簡(jiǎn) 要 說(shuō) 明
AH109 菌株來(lái)源于 PJ69-2A 酵母菌株，將 lacZ 報(bào)告基因引入 PJ69-2A 誕生了 AH109，此菌株是 Clontech 公司開(kāi)發(fā)
的 GAL4 系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa 型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)�；蚺c MATα型酵母菌株 Y187 通過(guò) mating 操作進(jìn)行蛋
白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker 為: trp1, leu2，報(bào)告基因?yàn)椋?/span>lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4
酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7。質(zhì)粒 PGBKT7 的篩選標(biāo)志為 TRP1，用于表達(dá) DNA-BD(來(lái)
自酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4N 端 1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒 PGADT7 的篩選標(biāo)志為 LEU，用于表
達(dá) AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（
Prey）的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4
可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N 端1 ~ 174 位氨基酸區(qū)段的DNA 結(jié)合域（DNA-BD）和位于C 端768 ~881 位
氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD 能夠識(shí)別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并與之結(jié)合。而 AD
可以啟動(dòng) UAS 下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD 和 AD 單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的 GAL4 活性，
使含有 UAS 的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD 不與 AD 結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與 BD 和 AD 融合，
形成 bait 融合蛋白（
bait -BD）和 prey 融合蛋白（
prey-AD），如果 bait 和 prey 發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD 和 AD 的
相互接近，形成完整的 GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109 有四個(gè)報(bào)告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由
三種不同的啟動(dòng)子（GAL1，GAL2，MEL1）啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有 GAL4 識(shí)別的 17bp核心區(qū)相同，其余部分均不
同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。AngYuBio High5TM 系列 AH109 感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保
存三個(gè)月，經(jīng) PGADT7 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA 。
操 作 說(shuō) 明
1. 取一支無(wú)菌的 1.5ml EP 管，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒 1-3µg，Carrier DNA 10µl，100µl 冰上融化的 AH109 感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻 6-8 次；
2. 30℃水浴 30min，每 10min 輕輕翻轉(zhuǎn)混勻 6-8 次；
3. 每支加入 20µl 的二甲基亞砜；（用于提高轉(zhuǎn)化效率）
4. 42℃水浴 15min，每 5min 輕輕翻轉(zhuǎn)混勻 6-8 次；
5. 12000rpm 瞬時(shí)離心棄上清，每支加入 1ml 的 YPD Plus 于 30℃復(fù)蘇 1h；（用于提高轉(zhuǎn)化效率）
6. 12000rpm 瞬時(shí)離心棄上清，用 100µl 0.9% NaCl 重懸，涂板，30℃培養(yǎng) 48-96h。
注 意 事 項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化,PEG 溶液在低溫環(huán)境下會(huì)析出，請(qǐng)于常溫下完全溶解后使用。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化 2-3 種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。
4. AHA109 酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長(zhǎng)溫度為 27-30℃；高于 31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完
畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破壞，Adenine 合成途徑
受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物 P-ribosylamino imidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使
菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂 YPDA
平板 29℃，48h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克��；涂 SD 單缺平板 29℃，48-60h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克隆，涂 SD 雙缺平
板 29℃，60-80h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃，80-90h 培養(yǎng)可見(jiàn)直徑 1mm 克隆。
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