AccurPrime RCA Kit采用引發(fā)酶（AccurPrimase Pol）來產(chǎn)生擴增引物，其與TruePrime RCA Kit 采用的Tth PrimPol Primase工作原理相似，這種不使用Random Hexamers（隨機引物）的擴增方式，確保了對模板的精準擴增，避免引物帶入的不確定堿基。Primase Pol結(jié)合在ssDNA上，以dNTP為底物合成短的互補引物，隨后在高保真和持續(xù)合成能力極強的Equi-phi29 DNA聚合酶的作用下，持續(xù)合成ssDNA，其新合成的ssDNA又可以作為Primase Pol的結(jié)合底物重新合成互補引物，進而繼續(xù)進行擴增，形成dsDNA。
該試劑盒中配備了dsDNA變性液（Buffer D），因此無論是ssDNA還是dsDNA均可以有效的作為擴增底物。以1ng的環(huán)狀質(zhì)粒模板，在2h內(nèi)可以獲得3 μg的擴增產(chǎn)物。以10 ng的genomic DNA（100-200kb）為模板，可獲得1-2 μg的產(chǎn)物。擴增終產(chǎn)物為大分子量的網(wǎng)狀dsDNA，其可用于酶切、測序與再連接。
產(chǎn)品描述：AccurPrime RCA Kit 與 TruePrime RCA Kit 工作原理相同，采用引發(fā)酶（Primase Pol）來產(chǎn)生擴增引物。這種不使用 Random Hexamers（隨機引物）的擴增方式，確保了對模板的精準擴增，避免引物帶入的不確定堿基。PrimasePol 結(jié)合在 ssDNA 上，以 dNTP 為底物合成短的互補引物，隨后在高保真和持續(xù)合成能力極強的 Equi-phi29 DNA 聚合酶的作用下，持續(xù)合成 ssDNA，其新合成的 ssDNA 又可以作為 Primase Pol 的結(jié)合底物重新合成互補引物，進而繼續(xù)進行擴增，形成 dsDNA。該試劑盒中配備了 dsDNA 變性液（Buffer D），因此，無論是 ssDNA 還是 dsDNA 均可以有效的作為擴增底物。以1 ng 的環(huán)狀質(zhì)粒模板，在 2h 內(nèi)可以獲得 3 μg 的擴增產(chǎn)物。以 10 ng 的 genomic DNA（100-200kb）為模板，可獲得1-2 μg 的產(chǎn)物。擴增終產(chǎn)物為大分子量的網(wǎng)狀 dsDNA，其可用于酶切、測序與再連接。
儲存：-20℃可保存 2 年。
注意：10×phi29 Buffer、Buffer D（變性液）、Buffer N（中和液）含有高濃度的鹽，實驗時務必做好防護。皮膚和眼睛接觸后，立即大量清水清洗，并就醫(yī)。
操作方法
1. 模板變性與中和
Template DNA（0.01-10 ng/μl） 2.5 μlBuffer D 2.5 μl漩渦混合均勻后，室溫放置3min后，立即加入2.5μl BufferN 進行中和（此時總體積為 7.5μl）。
注意：
（1）模板 DNA 可以是純化的質(zhì)粒、gDNA、菌液、培養(yǎng)細胞
（2）變性反應采用堿變性方法，因此變性時間不宜超過 5min，過長的時間會造成模板損傷。
2，擴增發(fā)應：
漩渦混合均勻后，放置于 30℃恒溫擴增 2h。必要情況下，65℃10min 進行失活反應。產(chǎn)物 4℃短期保存（<3 天），或-20℃長期保存。
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