4.     目的細(xì)胞最佳分離時(shí)間

血液離體后 2 小時(shí)內(nèi)。如達(dá)不到 2 小時(shí)內(nèi)分血條件，請(qǐng)務(wù)必于 4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分血步驟， 超過(guò) 4 小時(shí)很難順利進(jìn)行分離。

5.    分離液的使用環(huán)境

a.  分離液需常溫（15℃-25℃) 避光保存，嚴(yán)禁冷藏冷凍保存；

b.  使用時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范（超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)），并在 18℃-22℃環(huán)境溫 度下進(jìn)行操作，20℃條件下分離效果最佳。超出此溫度范圍，有可能使分離液密度發(fā)生 改變，造成分離效果不佳。

6.    參考值（目的細(xì)胞參考范圍）

本試劑盒可保證目的細(xì)胞的提取率大于 80% ，不是純度。如需獲得高純度目的細(xì)胞， 請(qǐng)配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量，減少成本。

【檢驗(yàn)方法】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃（試劑需要復(fù)溫。夏季 20℃ , 冬季 23℃ 。）的條件下進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)方法：方法一如下（不需血漿留存?zhèn)溆?/span>）：

1. 取一支 15ml 無(wú)菌離心管，先加入 5ml 分離液 1 ，后緩慢加入 2ml 分離液 2 ，形成梯度 界面，再緩慢吸取 2-3ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。或 取一支 50ml 無(wú)菌離心管，先加入 15ml 分離液 1 ，后緩慢加入 5ml 分離液 2 ，再緩慢吸 取 5- 15ml 新鮮抗凝血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。（分離液試劑總 量不得少于 4ml ，新鮮抗凝血不得少于 2ml �？傄后w量不得超過(guò) 2/3）。

2. 以 500g 或 600g ，離心 30min（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力 及離心時(shí)間。）

3. 離心后，離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層環(huán)狀乳白色為（人及各 種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層環(huán)狀乳白色為單個(gè)核 細(xì)胞層(下層50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì) 胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

4. ①小心吸取血漿層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中備用（分離效果不理想，可進(jìn)行后續(xù)處理方案）。 ②小心吸取離心管中的（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 B 中。

③小心吸取離心管中的單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 C 中。

5. 向含有（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層離心管 B 中，加入 5- 10ml 清洗液，混勻細(xì)胞。

6. 250g ，離心 10min 。棄去上清。

7. 用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。

8. 250g ，離心 10min ，棄去上清。

9. 重復(fù)清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液或根據(jù)下一步實(shí) 驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體，重懸所得細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)方法：方法二如下（需留取血漿備用）：

1.  首先取抗凝血，250g ，離心 10min ，抽取血漿留存?zhèn)溆�。補(bǔ)加胎牛血清(添加量與留存血 漿量等同)  制成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞懸液液體體積，選擇適當(dāng)離心管進(jìn)行試驗(yàn)。

2.  取一支 15ml 無(wú)菌離心管，先加入 5ml 分離液 1 ，后緩慢加入 2ml 分離液 2 ，形成梯度界 面，再緩慢吸取 2-3ml 細(xì)胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰�；蛉∫� 支 50ml 無(wú)菌離心管，先加入 15ml 分離液 1，后緩慢加入 5ml 分離液 2，再緩慢吸取 5- 15ml 細(xì)胞懸液血加于分離液液面之上。各液面分層一定要清晰。（分離液試劑總量不得少于 4ml ，細(xì)胞懸液不得少于 2ml �？傄后w量不得超過(guò) 2/3）。

3.  以 500g 或 600g ，離心 30min 。（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力 及離心時(shí)間。）

4.  離心后，離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層環(huán)狀乳白色為（人及 各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層環(huán)狀乳白色為單個(gè)核 細(xì)胞層(下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán))。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞 層。第六層為紅細(xì)胞層。

5.  ①小心吸取稀釋液層轉(zhuǎn)移到新離心管 A 中備用（分離效果不理想，可進(jìn)行后續(xù)處理方案）。 ②小心吸取離心管中的（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 B 中。

③小心吸取離心管中的單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管 C 中。

6.  向含有（人及各種動(dòng)物）樹(shù)突狀細(xì)胞層離心管 B 中，加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)： 2010X1118），混勻細(xì)胞。

7.  250g ，離心 10min 。棄去上清。

8.  用吸管吸取 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

9.  250g ，離心 10min ，棄去上清。

10.  重復(fù)清洗兩次，棄去上清，用 0.5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）或根據(jù)下一步實(shí) 驗(yàn)要求加入相對(duì)應(yīng)液體，重懸所得細(xì)胞。

分離圖

【分離過(guò)程中可能出現(xiàn)的情況及處理方案】

情況一：樹(shù)突狀細(xì)胞層和單個(gè)核細(xì)胞層混在一起不能分開(kāi)

1.     吸取全部白色環(huán)狀細(xì)胞層，清洗后用備用的血漿 1-2ml 重懸細(xì)胞。

2.     使用分離液 2 重新提取樹(shù)突狀細(xì)胞。

3.     取 15ml 離心管，加入 4ml 分離液 2 ，將用血漿重懸的 1-2ml 細(xì)胞緩慢加于分離液之液 面上，400g ，離心 20min。

4.     離心后，離心管可分為 4 層，第一層血漿層，第二層樹(shù)突狀細(xì)胞層，第三層分離液層， 第四層單個(gè)核細(xì)胞層。

5.     可重復(fù)檢驗(yàn)方法中的目的細(xì)胞洗滌方法，獲得樹(shù)突狀細(xì)胞

【注意事項(xiàng)】

1.  全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃（夏季 20℃ , 冬季 22-25℃) 的條件下進(jìn)  行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離 效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

2.  本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心 管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì) 變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

3.  分離液用量大于血液樣本時(shí)，分離效果更佳。

4.  吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

5.  如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)聯(lián)系 技術(shù)支持以尋求幫助，具體聯(lián)系方式 詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)樹(shù)突狀細(xì)胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1.    由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

2.    離心力公

3.    本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

4.    本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50- 100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果， 離心力最小不得小于 400g ，最大不得大于 1200g 。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。