本產(chǎn)品是 II發(fā)光法3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(簡(jiǎn)稱CTL 3D II，不同包裝版本，兩者的檢測(cè)效果完全一致。本產(chǎn)品，即CTL 3D為即用型液體，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需配制即可以直接使用，但長(zhǎng)期保存需要置于-80℃，如果在-20℃保存時(shí)間較長(zhǎng)后檢測(cè)效果會(huì)逐漸下降。CTL 3D II，為CTL 3D的凍干粉版本，優(yōu)點(diǎn)是在-20℃保存非常穩(wěn)定，缺點(diǎn)是使用前需要使用提供的緩沖液充分溶解底物凍干粉后才能使用。

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)大多以二維(Two-Dimensional, 2D)的形式進(jìn)行，隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)2D培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)方式、生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分化和生物學(xué)功能等方面都與體內(nèi)生理?xiàng)l件下的細(xì)胞存在明顯差異，進(jìn)而可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)的真實(shí)情況存在較大偏差 [1-3]。三維(Three-Dimensional, 3D)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能夠更好地模擬生物體內(nèi)細(xì)胞生存的微環(huán)境，細(xì)胞也可以保持其正常的生物學(xué)功能，能更好模擬體內(nèi)組織，也能更真實(shí)地反映細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，細(xì)胞對(duì)外源性和內(nèi)源性刺激的應(yīng)答也更接近于在體內(nèi)的情況，3D細(xì)胞培養(yǎng)從而成為更具好的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，能夠獲得與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更加相近或一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4-5]。

3D腫瘤細(xì)胞模型越來(lái)越多地被用于了解疾病機(jī)制和藥物研發(fā)。2D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其單側(cè)細(xì)胞膜可以均勻地獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣，而3D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞團(tuán)的內(nèi)部細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣的機(jī)會(huì)更少，形成自然的營(yíng)養(yǎng)和氧氣梯度，能更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境條件，因此3D培養(yǎng)的腫瘤球狀體(Spheroid)或腫瘤類器官(Organoid)等能更好地模擬體內(nèi)腫瘤，更利于小分子藥物篩選或者腫瘤相關(guān)分子機(jī)制的研究，也更能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)藥物治療的體內(nèi)反應(yīng)、療效或毒性。同時(shí)，2D腫瘤細(xì)胞模型體外擴(kuò)增有一定局限性，在傳代后容易喪失原腫瘤的遺傳異質(zhì)性，出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)克隆選擇性，從而降低臨床相關(guān)性。相比于2D細(xì)胞模型，3D細(xì)胞球或者類器官很多情況下下能提供更可信的研究結(jié)果，簡(jiǎn)化并加速藥物評(píng)價(jià)流程。自2009年小腸類器官首次建立至今，3D細(xì)胞和類器官研究已經(jīng)擴(kuò)展到很多組織系統(tǒng)，并成為生命科學(xué)最熱門的領(lǐng)域之一。

隨著3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為非常常用的研究工具，也越來(lái)越受歡迎，在基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)等中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，而3D培養(yǎng)條件下的細(xì)胞活性檢測(cè)也成為一大難點(diǎn)。

ATP，作為最重要的能量分子，在細(xì)胞的各種生理、病理過(guò)程中起著重要作用。ATP是細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，也是具有代謝活性細(xì)胞的重要標(biāo)志性分子，并和活細(xì)胞數(shù)目成良好的線性關(guān)系。因此，ATP含量能很好地反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)目，即可以通過(guò)測(cè)定ATP含量來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力。

本試劑盒的檢測(cè)試劑經(jīng)過(guò)優(yōu)化具有強(qiáng)勁的裂解能力，可有效滲透至3D培養(yǎng)形成的球狀體內(nèi)部，裂解所有細(xì)胞并釋放出ATP，最終通過(guò)測(cè)定ATP含量來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力。本試劑盒通過(guò)ATP檢測(cè)細(xì)胞活力的原理參見(jiàn)圖1。借助ATP依賴的螢光素酶催化的螢光素發(fā)光反應(yīng)，ATP可以通過(guò)測(cè)定化學(xué)發(fā)光來(lái)進(jìn)行定量。由于ATP含量能很好地反映活細(xì)胞的數(shù)目，而ATP含量和發(fā)光強(qiáng)度成正比，這樣就可以簡(jiǎn)單地通過(guò)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)計(jì)算出細(xì)胞活力或細(xì)胞數(shù)目。

圖1. 發(fā)光法3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(C0061)檢測(cè)ATP的原理圖。

本產(chǎn)品操作簡(jiǎn)單，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測(cè)速度快，完成檢測(cè)僅需約30分鐘。本產(chǎn)品比其它3D細(xì)胞活力測(cè)定方法更加簡(jiǎn)單便捷，只需把試劑盒提供的發(fā)光法3D檢測(cè)試劑與細(xì)胞培養(yǎng)液等體積混合，振蕩5分鐘，再室溫孵育25分鐘后即可進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。無(wú)需洗滌細(xì)胞，也無(wú)需更換或去除培養(yǎng)液。并且化學(xué)發(fā)光比較穩(wěn)定，在反應(yīng)開(kāi)始后的10分鐘內(nèi)下降不超過(guò)10%，30分鐘內(nèi)的下降不超過(guò)30%，信號(hào)半衰期長(zhǎng)達(dá)2-3小時(shí)。

本試劑盒的性能基本達(dá)到甚至在有些方面優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品。本產(chǎn)品的用途與Promega公司的CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay (簡(jiǎn)稱CellTiter-Glo^® 3D)基本相同。3D培養(yǎng)的細(xì)胞用本產(chǎn)品和國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)作用后細(xì)胞狀態(tài)基本一致(圖2)，但本產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度顯著優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P) (圖3、圖4B)，發(fā)光強(qiáng)度比國(guó)外同類產(chǎn)品提高了約15%，化學(xué)發(fā)光的信號(hào)穩(wěn)定性與國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)基本一致(圖4C)。本產(chǎn)品與國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)的檢測(cè)效果見(jiàn)圖2、圖3、圖4B和4C。

圖2. 發(fā)光法3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(C0061)和國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)加入到3D培養(yǎng)的細(xì)胞前后的細(xì)胞狀態(tài)圖。10,000個(gè)HCT-116細(xì)胞接種于康寧^®球體微孔板(Corning^® 96-well Black/Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Surface Spheroid Microplate, Cat.4515/4520)，培養(yǎng)72小時(shí)后加入本產(chǎn)品和Competitor P。圖A和圖B為加入3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑前的3D細(xì)胞球；圖C和圖D為加入3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑作用5分鐘后的3D細(xì)胞球形態(tài)；圖E和圖F為3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑作用后，對(duì)細(xì)胞的染色效果圖。實(shí)際檢測(cè)效果會(huì)因細(xì)胞種類、細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間等的不同而存在差異，本圖僅供參考。

圖3. 發(fā)光法3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒和國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)對(duì)ATP標(biāo)準(zhǔn)品和3D細(xì)胞的檢測(cè)效果。圖A為本產(chǎn)品和Competitor P對(duì)3,000nM和10,000nM ATP標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效果對(duì)比圖，圖B為5,000和10,000個(gè)HCT-116細(xì)胞在康寧^®球體微孔板培養(yǎng)72小時(shí)后用本產(chǎn)品和Competitor P的檢測(cè)效果對(duì)比圖。實(shí)際讀數(shù)會(huì)因細(xì)胞種類、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本產(chǎn)品發(fā)光強(qiáng)度高。對(duì)于相同種類的細(xì)胞樣品，本產(chǎn)品的發(fā)光效果比國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)強(qiáng)約15-20% (圖3、圖4B)，實(shí)測(cè)效果會(huì)因細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間等的不同而有所不同。

圖4. 發(fā)光法3D細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(C0061)和國(guó)外同類產(chǎn)品(Competitor P)對(duì)不同數(shù)量HCT-116細(xì)胞在康寧^®球體微孔板中的檢測(cè)效果。不同數(shù)量HCT-116細(xì)胞在康寧^®球體微孔板中培養(yǎng)72小后用本產(chǎn)品和Competitor P檢測(cè)細(xì)胞活性。圖A為不同數(shù)量HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72小時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)圖，圖B為本產(chǎn)品和Competitor P對(duì)培養(yǎng)72小時(shí)后的3D細(xì)胞活性檢測(cè)效果對(duì)比圖，圖C為本產(chǎn)品和Competitor P對(duì)10,000個(gè)HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后的化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性的檢測(cè)效果對(duì)比圖。實(shí)際讀數(shù)會(huì)因細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本產(chǎn)品檢測(cè)靈敏度高，測(cè)定樣品的線性范圍寬。使用本產(chǎn)品檢測(cè)在康寧^®球體微孔板培養(yǎng)72小時(shí)的HCT-116細(xì)胞活性，細(xì)胞種板量?jī)H為10個(gè)/孔時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度即可達(dá)空白孔的5倍左右，檢測(cè)靈敏度特別高。在發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量之間的線性關(guān)系上，對(duì)于3D培養(yǎng)的細(xì)胞，接觸抑制對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響以及大型細(xì)胞球狀體中央?yún)^(qū)域代謝活性降低或者細(xì)胞壞死的影響，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞接種培養(yǎng)數(shù)天后進(jìn)行活力測(cè)定的化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度和細(xì)胞的接種數(shù)量之間的關(guān)系通常為曲線，但是發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)隨著種板細(xì)胞數(shù)量的增加而升高(圖4B)。

本產(chǎn)品穩(wěn)定性好。本試劑盒中的發(fā)光法3D檢測(cè)試劑穩(wěn)定性好，反復(fù)凍融5次對(duì)檢測(cè)效果基本無(wú)影響，反復(fù)凍融10次檢測(cè)效果下降不超過(guò)10%。本產(chǎn)品4℃保存3天對(duì)檢測(cè)效果無(wú)顯著影響，4℃保存7天檢測(cè)效果下降不超過(guò)10%。室溫保存1天，仍可保留80%以上的檢測(cè)效果。37℃保存1天，可保持60%以上的檢測(cè)效果。

本產(chǎn)品使用靈活便捷。本產(chǎn)品不僅適合少量樣品的檢測(cè)，也非常適合大量樣品的高通量篩選(High-throughput screening)檢測(cè)，可用于各種培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的3D細(xì)胞球，包括細(xì)胞懸滴培養(yǎng)板、超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板、Matrix-Gel™基質(zhì)膠或Matrigel包被的平板、瓊脂糖包被的平板等。

對(duì)于96孔板，推薦使用100μl細(xì)胞培養(yǎng)液和100μl的檢測(cè)試劑，總體積為200μl，此時(shí)本產(chǎn)品每10ml可以進(jìn)行100次檢測(cè)。對(duì)于384孔板，推薦使用25μl細(xì)胞培養(yǎng)液和25μl的檢測(cè)試劑，總體積為50μl，此時(shí)本產(chǎn)品每10ml可以進(jìn)行400次檢測(cè)。也可以用其它體積的試劑進(jìn)行檢測(cè)，但細(xì)胞培養(yǎng)液和檢測(cè)試劑體積的比例須為1:1。

保存條件：

-20℃避光保存，至少一年有效。 -80℃避光保存，可以保存更長(zhǎng)時(shí)間。

注意事項(xiàng)：

本產(chǎn)品在-20℃保存其檢測(cè)效果會(huì)逐漸下降，保存一年后其發(fā)光效果會(huì)降低約40%。因此，如果希望本產(chǎn)品的發(fā)光效果更加穩(wěn)定，推薦在-80℃避光保存。如果訂購(gòu)后可能放置較長(zhǎng)時(shí)間后再使用，推薦訂購(gòu)在-20℃保存非常穩(wěn)定

螢光素酶的活性對(duì)溫度比較敏感，因此反應(yīng)前細(xì)胞和檢測(cè)試劑均需平衡至室溫后再進(jìn)行測(cè)定�？蓪�檢測(cè)試劑在不超過(guò)25℃的室溫或20-25℃的水浴中融解并混勻后使用。溫度的高低會(huì)影響化學(xué)發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)穩(wěn)定性。

本試劑盒的檢測(cè)試劑中含有螢光素酶，反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致其逐漸失活。盡管經(jīng)測(cè)試本試劑反復(fù)凍融5次對(duì)于其檢測(cè)效果無(wú)顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復(fù)凍融過(guò)程中，可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時(shí)宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測(cè)試不會(huì)影響后續(xù)的檢測(cè)效果。

待測(cè)藥物的溶劑含量較高時(shí)可能會(huì)干擾螢光素酶反應(yīng)，從而影響化學(xué)發(fā)光信號(hào)�？梢酝ㄟ^(guò)設(shè)置含有溶劑的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照孔排除溶劑的干擾。經(jīng)測(cè)試，最終反應(yīng)體系中DMSO含量在2%以內(nèi)不會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響。

檢測(cè)時(shí)需使用白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會(huì)產(chǎn)生相互干擾。也可使用專為3D培養(yǎng)的超低吸附培養(yǎng)皿或多孔板培養(yǎng)好3D細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至普通的白色或黑色多孔板中進(jìn)行檢測(cè)。提供各種超低吸附培養(yǎng)皿或多孔板及普通白色或黑色多孔板，詳見(jiàn)相關(guān)產(chǎn)品。

使用說(shuō)明中提供了檢測(cè)ATP標(biāo)準(zhǔn)品的方法，實(shí)際檢測(cè)細(xì)胞活力時(shí)通常并不需要檢測(cè)ATP標(biāo)準(zhǔn)品。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。