實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人新布尼亞病毒抗體(NBV-Ab)表達(dá)。用純化的人新布尼亞病毒NBV-Ab)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中新布尼亞病毒抗體(NBV-Ab)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的新布尼亞病毒抗體(NBV-Ab)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，與CUTOF℉值相比較，從而判定標(biāo)本中人新布尼亞病毒抗體(NBV-Ab)的存在與否。
標(biāo)本要求
1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1.編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
2.加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50u。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40，然后再加待測樣品10。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50ul,輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10.終止：每孔加終止液50山，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測定：以空白空調(diào)零，450m波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
計算和結(jié)果判定：
試驗(yàn)有效性：陽性對照孔平均值≥1.00：陰性對照平均值<0.10臨界值(CUT OFF)計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為新布尼亞病毒抗體(NBVAb)陰性陽性判定：樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為新布尼亞病毒抗體(NBV-Ab)陽性
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