NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）試劑盒
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。
測(cè)定原理：
NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)胞色素c生成還原型細(xì)胞色素c，還原型細(xì)胞色素c在550nm處有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定550nm吸光度的增加速率，來(lái)計(jì)算NCR活性。
自備儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前配制，加2.6 mL蒸餾水充分溶解，4℃保存。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前配制，加550 μL蒸餾水充分溶解，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱(chēng)約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1 mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。
測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL蒸餾水、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，第10 s和第130 s吸光值分別記為A1和A2，△A空白管=A2-A1。
4. 測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL粗酶液、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，第10 s和第130 s吸光值分別記為A3和A4，△A測(cè)定管=A4-A3。
注意：空白管只需要做一次。
計(jì)算公式：
(1).按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C為1個(gè)酶活單位。
NCR酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
= 529×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中，每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C為1個(gè)酶活單位。
NCR酶活性(nmol/min/g 鮮重)= (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷ T
= 265×(△A測(cè)定管-△A空白管)÷W
ε：還原型細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1010μL=0.00101L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，50μL=0.05mL；V樣總：加入提取液體積，0.5mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。
注意事項(xiàng)：
試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的4℃可保存兩天。NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）試劑盒
