注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格:100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 50mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 0.6mL×1 支，-20℃保存； 試劑三：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 支，4℃保存，臨用前加入 1mL 雙蒸水，用不完的試劑仍 4℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存，臨用前加入 500µL 雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存； 試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 1.5mL 雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

產(chǎn)品說(shuō)明：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)第一個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無(wú)色的DTNB 轉(zhuǎn)變成黃色的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本前處理

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 提取液和 10µL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

將勻漿液 600g，4℃離心 5min。

將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 CS。

在沉淀中加入 200µL 試劑一和 2µL 試劑二，反復(fù)吹打充分混勻，用于 CS 測(cè)定。檸檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。

二、測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑三置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱 10min 左右（保證無(wú)沉淀）。

3、操作表：

在微量玻璃比色皿/96 孔板中分別加入

加試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄 412nm 波長(zhǎng)下 10 秒時(shí)的初始吸光度 A1，之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng) 2 分鐘（96 孔板放入恒溫箱中）；迅速取出比色皿并擦干，412 nm 下記錄 2 分 10 秒時(shí)的吸光度 A2，上清液、沉淀的測(cè)定管、對(duì)照管均需測(cè)量(每個(gè)樣本需測(cè) 4 管)。

計(jì)算上清液的測(cè)定管∆A1=A2-A1，上清液對(duì)照管的∆A1’=A2-A1，沉淀的測(cè)定管∆A2=A2-A1， 沉淀的對(duì)照管∆A2’=A2-A1，計(jì)算∆A 上清=∆A1-∆A1’，計(jì)算∆A 沉淀=∆A2-∆A2’。

三、CS 活性計(jì)算：

1、按微量玻璃比色皿計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：37℃或 25℃下每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS 上清（U/mg prot）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反總÷（Cpr 上清×V 樣本）÷T

=1050×∆A 上清÷Cpr 上清

CS 沉淀（U/mg prot）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反總÷（Cpr 沉淀×V 樣本）÷T

=1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀

CS（U/mg prot）=CS 上清+CS 沉淀=1050×∆A 上清÷Cpr 上清+1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：37℃或 25℃下每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS 上清（U/g 鮮重）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣本÷V 提取）÷T =1061×∆A 上清÷W CS 沉淀（U/g 鮮重）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反總÷（W×V 樣本÷V 沉淀）÷T =212×∆A 沉淀÷W CS（U/g 鮮重）=CS 上清+CS 沉淀=1061×∆A 上清÷W+212×∆A 上清÷W。

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：37℃或 25℃下每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS 上清（U/104 cell）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反總÷（500×V 樣本÷V 提�。�÷T=2.1×∆A 上清CS 沉淀（U/104 cell）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反總÷（500×V 樣本÷V 沉淀）÷T =0.42×∆A 沉淀CS（U/104 cell）=CS 上清+CS 沉淀=2.1×∆A 上清+0.42×∆A 沉淀。

ε：TNB 的消光系數(shù)，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2 mL；d：比色皿光徑，1cm；V 樣本：加入的樣本體積，0.007mL；V 提�。禾崛∫后w積，1.01mL；V 沉淀：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr 上清：上清液的蛋白濃度，mg/mL；Cpr 沉淀：

 沉淀溶解后的蛋白濃度, mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)胞數(shù)量/細(xì)菌，500 萬(wàn)。

3、按 96 孔板計(jì)算：將上述公式中的 d=1cm 改為 d=0.6cm（96 孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1、測(cè)定過(guò)程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持 37℃或 25℃，取小燒杯一只裝入一定量的 37℃或 25℃蒸餾水， 將此燒杯放入 37℃或 25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3、最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4、用 96 孔板測(cè)定時(shí)，根據(jù)測(cè)定管數(shù)量配制測(cè)定管工作液（試劑三、四、五、六）和對(duì)照管工作液

（試劑三、四），因通過(guò)單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化計(jì)算酶活，不推薦同時(shí)測(cè)多個(gè)樣本。