注    意： 正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：                           

胃蛋白酶由胃粘膜主細(xì)胞分泌，分解食物中蛋白質(zhì)成小肽段。一般用于神經(jīng)性低酸癥的鑒別，慢性胃炎、慢性胃擴(kuò)張、慢性十二指腸炎等癥狀時(shí)也會(huì)引起胃蛋白酶分泌的減少。

測(cè)定原理：

胃蛋白酶可催化血紅蛋白水解，水解產(chǎn)物與福林試劑反應(yīng)后顯藍(lán)色；一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與胃蛋白酶活性呈正比。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入25 mL試劑二充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入25 mL蒸餾水充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30 mL蒸餾水充分溶解。

試劑六：液體5mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1.26mL×1支，0.5 μ mol/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度4℃保存。

粗酶液提取：

組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測(cè)定步驟：

1.分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到580 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三和試劑四置于37℃水浴預(yù)熱30min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取玻璃比色皿，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品，200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測(cè)光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 空白管：取玻璃比色皿，加入100μL蒸餾水，200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測(cè)光吸收，記為A空白管。

5. 對(duì)照管：取EP管，加入500 μL蒸餾水，置于37℃水浴保溫10min；加入500μL試劑四，蓋緊后搖勻1min；加入100μL粗酶液，混勻后8000g 4℃離心10分鐘取上清；在玻璃比色皿中加入上清液100μL，再加入200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測(cè)光吸收，記為A對(duì)照管。

6. 測(cè)定管：取EP管，加入100μL粗酶液，500 μL試劑三，置于37℃水浴保溫10min；加入500μL試劑四，

蓋緊后搖勻1min；8000g 4℃離心10分鐘取上清；在玻璃比色皿中加入上清液100μL，再加入200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測(cè)光吸收，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

(1) 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T=5500×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.5 μ mol/mL酪氨酸；稀釋倍數(shù)：（100+500+500）÷100=11；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g鮮重）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T=5500×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.5 μ mol/mL酪氨酸；稀釋倍數(shù)：（100+500+500）÷100=11；W：組織質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），100μL= 0.1 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

注意事項(xiàng)

試劑三、試劑四、試劑五臨用前配制，配制好用不完的試劑4℃可保存一周。