一、產(chǎn)品簡介
hESC/iPSC 細胞培養(yǎng)基試劑盒是廈門逸漠生物科技有限公司研發(fā)技術(shù)團隊開發(fā)的一種適用于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，成分明確，補充多種生長因子的人多能干細胞（hPSC）無血清培養(yǎng)體系。hESC/iPSC 在 hESC/iPSC 細胞培養(yǎng)基中可以快速增殖，而邊緣分化的細胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴增并獲得高純度人多能干細胞。
二、產(chǎn)品信息
表 1： hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基 試劑盒產(chǎn)品內(nèi)容
| 產(chǎn)品信息 | 規(guī)格 | 儲存條件 | |
| hESC/iPSC 細胞培養(yǎng)基試劑盒 | 1 Kit | 2℃～-20℃ | |
| hESC/iPSC Basal Medium | 400mL | 2℃～8℃ | |
| hESC/iPSC Grouth SupplementsA | 20mL | -20℃ or -80℃ | |
| hESC/iPSC Grouth Supplements B | 80mL | -20℃ or -80℃ | |
| hESC/iPSC Supplement C | 1mg | -20℃ or -80℃ |
表 2： hESC/iPSC 其他相關(guān)試劑 產(chǎn)品內(nèi)容
| 產(chǎn)品信息 | 規(guī)格 | 儲存條件 | |
| hESC/iPSC Passage Solution | 500 mL | 2℃～8℃ | |
| hESC/iPSC Cryopreservation Solution | 50mL | 2℃～8℃ | |
| hESC/iPSC Planking Solution Supplement | 1.2mL | -20℃ or -80℃ | |
| hESC/iPSC Planking Solution Basal Medium | 90mL | 2℃～8℃ |
三、試劑材料
表 3：其他試劑&材料
| 試劑&材料 | ||
| DMEM/F12 培養(yǎng)基 | ||
| 6/12/24 孔板 | -- | -- |
| 1 mL/5 mL/10 mL/25 mL 移液管 | -- | -- |
| 15 mL/50 mL 離心管 | -- | -- |
| 1.5/2 mL 凍存管 | -- | -- |
| 梯度程序降溫盒 | -- | -- |
四、 試劑準備
1 ）hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基配制（500 mL ）
1. 在 4℃條件下解凍 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B，勿在 37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。
2. 在生物安全柜中，使用無菌移液管將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 與 hESC/iPSC Basal Medium 混勻配制成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后根據(jù)使用情況將培養(yǎng)基分 裝，封口膜封好，確保置于 4℃儲存的培養(yǎng)基 2 周內(nèi)使用完畢，其余培養(yǎng)基于-20℃冷凍保 存，需要時提前于 4℃過夜解凍。
2 ）Matrigel 鋪板（以 Corning® Matrigel® 包被 6 孔板為例 ）
A. 分裝 Matrigel
1. Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推薦 Dilution Factor 為 278 μL，則表明 278 μL 可包被 4 塊 6 孔板，分裝數(shù)量=5 mL/0.278=17.98。
2. 準備 18 個無菌 1.5 mL EP 管，標記 Matrigel 日期、操作人；1mL 無菌吸頭；EP 管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷 1 小時。
3. 將 Matrigel 放置 4℃冰箱過夜解凍，當 Matrigel 完全解凍即可開始分裝。
注：在解凍時，將 Matrigel 放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。
4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預(yù)冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。
5. 混勻 Matrigel，無菌分裝于各個 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導致分裝體積不準時需要更換吸頭。
6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。
B. 鋪板
1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 離心管中，準備 4 個 6 孔板，標記 Matrigel、批號、日期和操作人。
2.1 mL 無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷 1 小時，取出一支冷凍的 Matrigel（5mL）置于 4℃冰箱解凍至完全化凍。
3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預(yù)冷的 1mL 吸頭放置于生物安全柜上。
4. 用預(yù)冷的吸頭向解凍過的 Matrigel（5mL），加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反復(fù)吹打解凍并混勻。
5. 吸出已解凍混勻的 Matrigel 加入離心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反復(fù)吹打混勻。
6. 分裝 1.5 mL/孔于 4 個六孔板中，輕輕搖晃混勻。
7. 培養(yǎng)板置于室溫 1 小時后即可使用，或置于 4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。
五 、 復(fù)蘇 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）
1. 將水浴鍋預(yù)熱至 37℃。將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復(fù)至室溫（15~30℃）。
2. 取 2 mL hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，加入 4uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM，取 9mL DMEM/F12，加入 18uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM，恢復(fù)至室溫。。
注意：不要在 37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。
3. 取出 1 支冷凍的細胞置于 37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min 內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時取出。
4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準備好的 15 mL離心管中，隨后逐滴加入 9mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160 g 離心 5 min。
5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基。
6. 離心完吸棄上清，至留下 50uL 左右的上清，輕彈管底 3-4 下至細胞混勻在上清中， 逐滴緩慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，輕彈管底 3-4 下 混勻細胞，將這 1mL 細胞懸空滴加進 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基中。
7. 水平十字搖勻三次，置于 37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字 搖勻三次培養(yǎng)。
注：水平十字搖勻 3 次，左右兩次+上下兩次算一次。
8. 18-24 小時后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。
表 4： hESC/iPSC 傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量
| 培養(yǎng)容器 | 底面積 | DPBS（mL） | EDTA 傳代工作液 | hPSC 培養(yǎng)基* |
| 6 孔板 | 9.6 cm2/孔 | 1mL/孔 | 1 mL/孔 | 1 mL/孔 |
| 12 孔板 | 4.5 cm2/孔 | 0.5mL/孔 | 0.5mL/孔 | 0.5 mL/孔 |
| 24 孔板 | 2 cm2/孔 | 0.3mL/孔 | 0.3 mL/孔 | 0.5 mL/孔 |
六 、傳代 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）
圖 1.hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng) hESC 細胞形態(tài)圖：（A）和（C）分別 為 hESC 細胞培養(yǎng)第 2 和 4 天時低倍鏡 hESC 培養(yǎng)形態(tài)圖示，（B）和（D ）為培養(yǎng)至第 2 和 4 天時的高倍鏡hESC 培養(yǎng)形態(tài)圖。
1. 傳代條件：① 細胞匯合度達 85%左右（如圖 1(C-D)所示），一般情況下每 3-4 天傳代；
② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。
注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過 5 天。
2. 傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按 1:5~1:12 的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度 85%，大小均勻（如圖 1(C-D)所示），建議按照 1:8 進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。
注：1:8 傳代就是 1 個孔瓶傳 8 個孔（以 6 孔板為例）。
3. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復(fù)至室溫（~25℃）。
4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C 終濃度為 10uM，恢復(fù)至室溫（~25℃）。
5. 將細胞六孔板孔內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入 1 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃后吸棄。
6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆蓋孔底。
7. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 5-7 min。
注：① 消化 5-6 min 后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基 質(zhì)，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間，不超過 8min；
② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。
圖2 ：消化 hESC 細胞不同時間形態(tài)圖：（A）消化 6 min 低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化 7 min低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的的形態(tài)圖。
8.消化時吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。
9.消化結(jié)束后輕輕地將細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除 hESC/iPSC Passage Solution。及時加入 1 mL/孔預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，將細胞吹下來。
注：① 加 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C 時，可輕柔吹打細胞不能 超過 2 次，避免反復(fù)吹打；有部分細胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正�，F(xiàn)象，若有大量細 胞未脫離則需延長消化時間（< 8min）。
10.把這一毫升細胞懸液懸空滴加入板里的培養(yǎng)基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上標記細胞名 稱、代次、傳代比例、日期、操作人，水平十字搖勻 3 次。
注：可將傳完代后的細胞在鏡下觀察細胞密度，根據(jù)密度調(diào)整是否需要多加細胞滴。
11.置于 37℃，5% CO2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻 3 次，不要疊 放。
12. 18-24 小時后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，此后每天換液，第 4 天繼續(xù)傳代/凍存。
注：傳代后隔天算第 1 天。
七、凍存 hESC/iPSC
1. 當細胞匯合度達 85%左右（如圖 1(C-D)所示）可收獲凍存，一般 6 孔板每孔可凍存 1 管。
2. 準備相應(yīng)數(shù)量的 1.5/2 mL 凍存管，標記細胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。
3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。
4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。
5. 加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于 37℃培養(yǎng)箱中，計時 8-9 min（可參考“ 六、傳代 hESC/iPSC”步驟）。
6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。
7. 搖勻預(yù)溫的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻 3 次，隨后吸取細胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。
8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。
八、其他培養(yǎng)體系中 hESC/iPSC 更換為 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基條件的適應(yīng)
其他無飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)的 hESC/iPSC 可以在細胞狀態(tài)良好時，使用原培養(yǎng)基進行細胞傳代，24 小時后更換成混合培養(yǎng)基（原培養(yǎng)基與 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基按照 1:1 混合）培養(yǎng)，培養(yǎng) 2 代后完全換成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng) 2-3 代后可完全適應(yīng)新的培養(yǎng)體系，此時可進行細胞凍存處理。
