傳代方法	第一次建議1:2傳代	傳代情況	2天換液
備注	來(lái)源：48歲男性淋巴瘤外周血組織 用無(wú)菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基，留作過(guò)渡培養(yǎng)

 

細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶，消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無(wú)菌操作，將細(xì)胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。（傳代后建議一瓶用原瓶的完全培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基，以便進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)，換液擰松瓶蓋）

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

a、細(xì)胞傳代：如果未超過(guò)80%匯合度時(shí)，將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml完全培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，

1）對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，使之完全脫落后吸出，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25瓶），補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含8ml完全培養(yǎng)基的新瓶中。

方法二：可選擇半換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8ml完全培養(yǎng)基新瓶中。

b、細(xì)胞凍存：

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min；

3、 棄上清，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無(wú)血清凍存液（貨號(hào)：C7001），混勻后加入凍存管中。

4、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時(shí)以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中。

C、細(xì)胞復(fù)蘇：

1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3、棄上清，沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸，接種至T25培養(yǎng)瓶，放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞貼壁不牢，在運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生容易細(xì)胞脫落，這是正�，F(xiàn)象�？蓪⑴囵B(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5min，收集上清作過(guò)渡培養(yǎng)（后期對(duì)比培養(yǎng)），沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25），補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。