[產(chǎn)品使用方法]

1.人間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基準(zhǔn)備

將間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清生長(zhǎng)添加劑(MSCGs)在2-8*C過(guò)夜融化，按1:20比例加入基礎(chǔ)

培養(yǎng)基中，即成為間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

溫馨提示:間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基2-8*C避光條件下，可保存30天。若小量多次

使用，建議您將間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清生長(zhǎng)添加劑(MSCGs)分裝后，保存于-20°C冰箱,可

避免培養(yǎng)基不必要的浪費(fèi)。

2.人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇(以T-75瓶為例)

①?gòu)谋�箱中取出完全培養(yǎng)基，在生物安全柜或超凈臺(tái)中吸取適量(如T-75瓶: 10-

15mL)完全培養(yǎng)基沿_上表面加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,切勿沖到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面，即:

細(xì)胞生長(zhǎng)面。然后慢慢將細(xì)胞培養(yǎng)瓶平放，在37°C. 恒溫CO2培養(yǎng)箱中放查5- 10分鐘后

使用。

溫馨提示:請(qǐng)嚴(yán)格按照此步驟操作，否則可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)空白區(qū)

域，即所謂的“生長(zhǎng)空洞”。多數(shù)用戶使用的不是專用的預(yù)包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，而是普通的

細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，其表面環(huán)境并不利于無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境下的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁。

37C放置5-10分鐘，可讓培養(yǎng)基中的促貼壁物質(zhì)更好地與細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部結(jié)合,使得間

充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁能力增強(qiáng)，降低“生長(zhǎng)空洞”出現(xiàn)的概率。

②從液氮中取出凍存的間充質(zhì)干細(xì)胞，迅速將凍存管放入37°C水浴中，快速融解。

溫馨提示:盡可能避兔水沒過(guò)管帽，以減少污染的風(fēng)險(xiǎn);要快速完成細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程

(盡量控制在1分鐘內(nèi)) ,融化過(guò)程時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成復(fù)蘇后細(xì)胞活性較差。

③用70%-75%酒精消毒凍存管外壁，在生物安全柜或超凈臺(tái)中打開凍存管，用吸管/

移液器將細(xì)胞凍存懸液緩慢移入裝有5-10mL細(xì)胞完全培養(yǎng)基的15mL離心管中(在這一

過(guò)程請(qǐng)盡可能避免產(chǎn)生氣泡)。

溫馨提示:為了減少細(xì)胞損失，往細(xì)胞凍存管中加入1mL完全培養(yǎng)基,稍微吹打，用

吸管/移液器將這1mL的細(xì)胞懸液吸入離心管中，再用吸管/移液器將離心管中的細(xì)胞輕輕

吹打混勻。

④1200rpm離心5min，棄上清，加入2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，

按密度2x 104ells/cm2將細(xì)胞接種至步驟①中孵育完的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，添加細(xì)胞時(shí)，將

細(xì)胞培養(yǎng)瓶豎立，細(xì)胞懸液直接加到底部，切忌沖到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面。

⑤輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)器皿，使細(xì)胞均勻分布，混勻后，置于37°C. 5%CO2、飽和濕

度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

⑥24h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基(溫育至37°C) 。

3.人間充質(zhì)干細(xì)胞傳代(以T 75瓶為例)

①在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%， 即可傳代。

溫馨提示:細(xì)胞融合度請(qǐng)勿超過(guò)90%。很多傳代后的細(xì)胞大比例死亡，是由于傳代

前細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密(融合度過(guò)高)， 導(dǎo)致細(xì)胞消化異常(細(xì)胞整片或成片脫落)， 加之隨后

的不當(dāng)操作(如用移液器反復(fù)吹打成片細(xì)胞使其成為單個(gè)細(xì)胞)，此機(jī)械損失過(guò)程會(huì)嚴(yán)重

損害細(xì)胞膜，引發(fā)大比例的細(xì)胞死亡;間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)凍存后再次使用時(shí),尤為明顯。

②預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶，處理方法同細(xì)胞復(fù)蘇中的步驟①.

③在生物安全柜或超凈臺(tái)中，棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入5- 10mL PBS清洗細(xì)

胞后棄去，再加入2mL 0.05%胰酶EDTA消化細(xì)胞。

④在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變園時(shí)，立即加入5mL胰酶抑制劑終止消化。

⑤用移液器輕輕吹打瓶壁上還未完全脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞完全分

散。

⑥將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1200rpm離心5min. 棄上清，加入2mL細(xì)胞

完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),按細(xì)胞密度2x 1o4ells/cm2,將細(xì)胞接種至細(xì)

胞傳代②步驟中孵育完的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，添加細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶豎立，細(xì)胞懸液直接

加到底部，切忌沖到細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面。

⑦輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)器皿，使細(xì)胞均勻分布，混勻后，置于37°C、 5%CO2. 飽和濕

度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

4、人間充質(zhì)干細(xì)胞凍存

①用0.05%胰酶-EDTA消化待凍存的細(xì)胞，加入胰酶抑制劑終止消化并離心，重懸后進(jìn)

行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

②1200rpm離心5min,棄上清。

③根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)情況，緩慢加入適量冷的無(wú)血清東存液(無(wú)血清凍存液可即拿即用或置

于冰袋備用)，調(diào)整細(xì)胞密度在1×10?cells左右。

④輕輕地重縣細(xì)胞，將重縣均勻的細(xì)胞按等份加入到滅瑩的凍存管中(需提前做好標(biāo)

記)，旋緊凍存管蓋。

⑤迅速將凍存管放入程序降溫盒中，然后將凍存盒直接放入-80°C冰箱。

⑥過(guò)夜放置后，將細(xì)胞從-80°C冰箱轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。